四川省宜賓地區(qū)健康成人外周血淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間的建立 *

劉 炳，郭 欣，鄭 凡，江燕紅，蔣淼璐

(宜賓市第二人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.普外科，四川宜賓 644000)

隨著流式細(xì)胞技術(shù)在臨床上的廣泛運(yùn)用，淋巴細(xì)胞亞群分析能客觀反映機(jī)體當(dāng)前的免疫功能，在艾滋病、白血病、腫瘤疾病、感染性疾病等疾病的輔助診斷、發(fā)病機(jī)制分析、療效觀察及預(yù)后判斷方面具有重要意義[1-4]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間，也無(wú)針對(duì)四川省宜賓地區(qū)人群的相應(yīng)參考區(qū)間。為更好地指導(dǎo)臨床診療，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinical laboratory standards institute，CLSI)對(duì)檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間設(shè)定的推薦程序[5]，擬對(duì)303例健康成人外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，以建立本地區(qū)健康成人參考區(qū)間。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 選取2018年1～6月303例健康體檢人群，清晨空腹無(wú)菌靜脈血2 ml，EDTA抗凝，4 h內(nèi)完成檢測(cè)。年齡18～86歲，其中男性172例，女性131例。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)分類方法將體檢人群分為18～44歲為青年組125例，45～59歲為中年組96例≥60歲為老年組82例。同時(shí)選取10例艾滋病晚期的病人，5例T淋巴瘤，5例急性B淋巴細(xì)胞白血病作為疾病對(duì)照組，以驗(yàn)證本研究所得參考區(qū)間的正確性，入選對(duì)照組病例均符合相應(yīng)疾病2018版臨床診療規(guī)范。入選研究人群必須符合如下條件：①無(wú)現(xiàn)病史、無(wú)吸煙史、無(wú)酗酒史，沒(méi)有影響檢測(cè)結(jié)果的生理指征；②實(shí)驗(yàn)室檢查：血細(xì)胞計(jì)數(shù)正常，心、肝、腎功能檢測(cè)正常；③無(wú)血液系統(tǒng)疾病、無(wú)免疫系統(tǒng)疾病、無(wú)HIV，HBV，HCV，梅毒和其它急性傳染性疾??；④女性不在月經(jīng)期、妊娠期、哺乳期。本研究經(jīng)宜賓市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均告知其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并簽署知情同意書。

1．2 試劑與儀器 試劑為杭州艾森生物科技有限公司產(chǎn)品：四色免洗淋巴細(xì)胞亞群分析試劑(CD3-FITC/CD8-PE/CD45-Percp/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-Percp/CD19-APC)，BECKMAN COULTER IMMUNO-TROL Cells質(zhì)控血，ACEA NovoCyte QC Particles微球校準(zhǔn)品等；儀器：ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀。

1．3 方法

1．3．1 儀器校正：取出ACEA NovoCyte QC Particles微球校準(zhǔn)品平衡至室溫，渦旋混勻5s，在0.5 ml PBS液中加入1滴熒光微球，渦旋混勻，每次開機(jī)用ACEA NovoCyte QC Particles對(duì)流式細(xì)胞儀器進(jìn)行光路及液路的校準(zhǔn)，記錄前向散射光(FS)及各熒光信號(hào)的半峰變異系數(shù)(HPCV)值，追蹤一段時(shí)間內(nèi)HPCV的變化，要求變異系數(shù)(CV)控制在3%以內(nèi)，以確保儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。每次檢測(cè)用BECKMAN COULTER IMMUNO-TROL Cells質(zhì)控血進(jìn)行一次室內(nèi)質(zhì)控，操作與標(biāo)本檢測(cè)相同。

1．3．2 標(biāo)本檢測(cè)：檢測(cè)過(guò)程根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，每份標(biāo)本同時(shí)做2管，即CD3-FITC/CD8-PE/CD45-Percp/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-Percp/CD19-APC。在每一管中分別加入相應(yīng)熒光抗體試劑20 μl及反向加入混勻的抗凝全血50 μl于各試管底部，旋渦混合后置室溫暗處孵育15 min，然后加入已稀釋的10倍溶血液450 μl，再置室溫暗處溶血15 min，渦旋混勻5 s后上機(jī)分析，利用NovoExpress軟件按順序測(cè)定各管的光散射及熒光信號(hào)并同時(shí)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 質(zhì)量保證 參加衛(wèi)健委室間質(zhì)評(píng)成績(jī)滿意，室內(nèi)質(zhì)控在控。

2 結(jié)果

2.1 不同性別健康成年人外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較 見表1。各組數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，不同性別CD3+(個(gè)/μl)，CD3+CD4+(%)，CD3+CD4+(個(gè)/μl)，CD3+CD8+(%)，CD3+CD8+(個(gè)/μl)，CD4+/CD8+，CD3-CD19+(%)，CD3-CD19+(個(gè)/μl)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；但男性CD3+(%)低于女性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，男性CD3-CD16+CD56+(%)，CD3-CD16+CD56+(個(gè)/μl)均高于女性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同性別健康成人淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果比較

2.2 不同年齡組健康成年人外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較 見表2。各組數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，各年齡組除CD3+CD4+(個(gè)/μl)，CD3-CD19+(%)，CD3-CD19+(個(gè)/μl)，CD3-CD16+CD56+(個(gè)/μl)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目各年齡組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

表2 不同年齡組健康成人淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果比較

注：a青年組與中年組相比，P<0.05；b青年組與老年組相比，P<0.05；c中年組與老年組相比，P<0.05；d青年組與中年組相比，P>0.05；e中年組與老年組相比，P>0.05。

2.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 入選疾病病例中10例艾滋病晚期病例，CD3+CD4+(%)及CD3+CD4+(個(gè)/μl)計(jì)數(shù)均低于本研究所得參考區(qū)間，5例T淋巴瘤病例CD3+(%)及CD3+(個(gè)/μl)計(jì)數(shù)均高于本研究所得參考區(qū)間，5例急性B淋巴細(xì)胞白血病中CD3-CD19+(%)及CD3-CD19+(個(gè)/μl)計(jì)數(shù)均高于本研究所得參考區(qū)間，說(shuō)明本研究結(jié)果對(duì)于臨床診療有效。

3 討論

淋巴細(xì)胞是人類免疫系統(tǒng)的組成部分，按其發(fā)生遷移、表面分子和功能的不同，可分為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞按功能又可分為輔助性T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等，臨床上很多疾病如感染性疾病、免疫缺陷性疾病、腫瘤性疾病及藥物的使用均可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的變化，比如評(píng)價(jià)艾滋病病程的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)為CD3+CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)[6-8]。為此確定淋巴細(xì)胞亞群的正常參考區(qū)間對(duì)臨床診療很有必要。

目前階段我們使用的參考區(qū)間多來(lái)源于試劑說(shuō)明書、教科書、文獻(xiàn)報(bào)道等，此類參考區(qū)間的來(lái)源多局限于部分實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)而不具普遍代表性。淋巴細(xì)胞亞群的參考區(qū)間受社會(huì)、環(huán)境等多因素的影響，不同地區(qū)、種族、年齡的人群淋巴細(xì)胞免疫分型存在差異[9-11]，此類參考區(qū)間無(wú)法滿足本地區(qū)臨床診療的需要，從表1、表2可以看出，部分淋巴細(xì)胞亞群項(xiàng)目參考區(qū)間與性別、年齡有相關(guān)性，這與梁君等[12-13]報(bào)道相似。本研究中部分淋巴細(xì)胞亞群項(xiàng)目的百分比在分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其對(duì)應(yīng)的絕對(duì)計(jì)數(shù)在分組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究選用儀器的檢測(cè)原理有關(guān)，本研究淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)采用單平臺(tái)體積法計(jì)算原理，這有別于采用微球計(jì)數(shù)原理的流式細(xì)胞儀，進(jìn)一步證實(shí)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)的參考區(qū)間建立還應(yīng)考慮儀器檢測(cè)原理等因素，尤其是有不同檢測(cè)系統(tǒng)的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。從表3中還發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目也會(huì)發(fā)生一定的變化，這與相關(guān)報(bào)道相似[14]，這可能與淋巴細(xì)胞的生理功能有關(guān)。同時(shí)將本研究所得外周血淋巴細(xì)胞參考區(qū)間與我院現(xiàn)使用參考區(qū)間比較，從中可以看出除男性CD3-CD16+CD56+(個(gè)/μl)與現(xiàn)使用的參考區(qū)間進(jìn)行比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各項(xiàng)目與現(xiàn)使用的參考區(qū)間進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用本研究建立的參考區(qū)間與相關(guān)疾病進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，20例病例結(jié)果均在參考區(qū)間之外。本研究所得參考區(qū)間因考慮性別、年齡等因素，其結(jié)果更符合臨床診療的實(shí)際情況。

本研究證實(shí)淋巴細(xì)胞亞群存在年齡、性別及檢測(cè)儀器型號(hào)等差異，這與WONG等[15]研究相似，因此各實(shí)驗(yàn)室要根據(jù)具體情況制定符合的參考區(qū)間，建立本地區(qū)健康成年人外周血淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間，并擴(kuò)展其運(yùn)用領(lǐng)域。本地區(qū)是我省艾滋病高流行區(qū)之一，有利于今后預(yù)防、診斷AIDS，為抗病毒治療以及療效評(píng)價(jià)提供更為有效、準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。本研究不足之處是未將未成年人納入研究范圍，尚需要多中心大規(guī)模實(shí)驗(yàn)室共同對(duì)健康人群參考區(qū)間做進(jìn)一步調(diào)查研究。