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    上海地區(qū)臨床實驗室HCV RNA檢測正確度驗證結果分析 *

    2019-10-16 11:05:10蔣玲麗楊依綃黃中強王雪亮肖艷群
    現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志 2019年5期
    關鍵詞:二級標準正確度試劑

    蔣玲麗,楊依綃,黃中強,王雪亮,鮑 蕓,肖艷群

    (上海市臨床檢驗中心,上海 200126)

    丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的HCV是最常見的傳染性肝病之一,治療前的HCV核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)載量檢測對治療診斷起著重要作用[1]。根據(jù)上海市臨床檢驗中心(以下簡稱“中心”)近幾年HCV RNA室間質(zhì)量評價(external quality assessment,EQA)反饋數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結果,發(fā)現(xiàn)各實驗室檢測結果和各試劑組檢測值之間存在一定的差異。為使不同實驗室間測定結果具有可比性,可通過相應的參考方法或標準物質(zhì)進行量值溯源[2],因此2015年中心制備了HCV RNA國家二級標準物質(zhì)[編號:GBW(E)090628][3]。2018年中心利用制備的二級標準物質(zhì)在上海地區(qū)開展了HCV RNA正確度驗證計劃,用以評價上海地區(qū)臨床實驗室HCV RNA檢測結果的正確度。

    1 材料和方法

    1.1 參控實驗室 上海地區(qū)開展HCV RNA檢測實驗室。

    1.2 儀器與試劑 瑞士羅氏公司生產(chǎn)的Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48檢測系統(tǒng)及其配套試劑,方法為內(nèi)標定量法。美國ABI公司生產(chǎn)的ABI7500全自動擴增儀檢測系統(tǒng),試劑由上海科華生物工程股份有限公司生產(chǎn),方法為柱提法。

    1.3 方法

    1.3.1 正確度調(diào)查樣本收集自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科HCV RNA檢測后的剩余血清樣本。混合均勻(剔除溶血和脂血樣本),去除沉淀后700 μl/支分裝,制備成低濃度(約104IU/ml)和高濃度(105IU/ml)2個樣本,編號為HCV RNA 1號和HCV RNA 2號。

    1.3.2 調(diào)查樣本評估按照中國合格評定國家認可委員會(China national accreditation service for conformity assessment,CNAS)GL03《能力驗證計劃樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》要求評估調(diào)查樣本的均一性和穩(wěn)定性。每個濃度抽取10支樣本,每支檢測2次,評估樣本均勻性;抽取6套樣本在2~8℃放置3天后檢測,評估樣本穩(wěn)定性。

    1.3.3 正確度計劃實施將3套共6支樣本通過冷鏈系統(tǒng)運輸?shù)礁髋R床實驗室。要求臨床實驗室收到樣本后立即將其存放在-20℃以下冰箱中。實驗室將樣本分3批次檢測(注:3批次為不同檢測日期),每批次分別取1套樣本,平衡至室溫后混勻,瞬時離心后檢測。要求實驗室每支樣本重復測定3次(共18個測試數(shù)據(jù)),在2周內(nèi)將所有檢測結果上傳至中心數(shù)據(jù)庫,超過規(guī)定時間系統(tǒng)不再接收數(shù)據(jù)。檢測后剩余樣本按照生物安全要求進行處理。

    1.3.4 定值[3-4]采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48檢測系統(tǒng),將正確度驗證樣本溯源至HCV RNA國家二級標準物質(zhì)[GBW(E)090628]。將國家二級標準物質(zhì)稀釋成7個濃度,每個濃度重復檢測3次,求回歸方程。要求二級標物每次定值實驗檢測均值在靶值±不確定度范圍內(nèi)為數(shù)據(jù)有效。正確度調(diào)查樣本每個濃度重復檢測10次,計算均值代入回歸方程求出正確度驗證樣本的含量。分3個批次定值,計算3次定值均值作為最終定值結果。

    1.3.5 結果分析使用上海市臨床檢驗中心的室間質(zhì)評管理平臺進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理,以每個樣本的對數(shù)值為統(tǒng)計值,計算按不同試劑分組后各試劑組的變異系數(shù)(coefficients of variation,CV)、偏移及所有回報結果的單個臨床實驗室室內(nèi)CV,偏移。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價靶值±0.4 logIU/ml的評價標準對實驗室檢測結果進行評價。

    1.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用log值轉(zhuǎn)換后進行統(tǒng)計。均勻性評估采用方差齊性檢驗,穩(wěn)定性評估采用t檢驗。

    2 結果

    2.1 均勻性和穩(wěn)定性評估 計算低高2個濃度樣本均勻性檢測結果,作方差齊性檢驗,F(xiàn)分別為2.253 9和1.117 8,F(xiàn)0.05(9,10)=3.02,F(xiàn)0.05,檢測結果差異無統(tǒng)計學意義,表明正確度樣本符合均勻性要求。統(tǒng)計正確度樣本在2~8℃放置3天的穩(wěn)定性評估檢測數(shù)據(jù),通過檢驗,計算t值分別為-0.73和0.03,t0.05(10)=2.228,t0.05,檢測結果差異無統(tǒng)計學意義,表明正確度樣本是穩(wěn)定的。

    2.2 賦值結果 以國家二級標準物質(zhì)[GBW(E)090628]為溯源進行賦值,分3批進行。每批分析過程中二級標物均重復檢測3次,取3次賦值的均值作為正確度樣本賦值結果,分別為3.02×104和3.39×105IU/ml。

    2.3 正確度調(diào)查分析

    2.3.1 不同試劑組組內(nèi)CV及偏移分析:見表1。2個樣本不同試劑組組內(nèi)CV分別為0.78%~8.53%和0.94%~6.21%,檢測結果與靶值的偏移分別為-4.69%~13.17%和-3.44%~6.51%,不同試劑組間檢測均值最大差值分別為0.65和0.55logIU/ml。

    表1不同試劑組檢測均值、組內(nèi)CV和偏移

    試劑組1號樣本均值(logIU/ml)CV(%)偏移(%) 2號樣本均值(logIU/ml)CV(%)偏移(%)1234564.584.274.924.825.074.423.838.531.911.370.782.102.20-4.699.827.5913.17-1.31 5.535.575.895.695.795.343.536.211.271.111.980.94-0.010.726.512.894.70-3.44

    2.3.2 單個實驗室室內(nèi)CV及偏移分析:回報結果的16家實驗室中2個樣本單個實驗室室內(nèi)CV分別為0.47%~8.53%和0.58%~6.21%;檢測均值與靶值的偏移分別為-0.89%~13.17%和-4.88%~6.51%。不同實驗室間檢測均值最大差值分別為0.80和0.63 logIU/ml,詳見圖1,圖2。實驗室符合率結果見表2。

    表2 實驗室符合率

    圖1 實驗室室內(nèi)CV

    圖2 實驗室偏移

    3 討論

    EQA是評價臨床實驗室檢測質(zhì)量、促進實驗室提高檢測結果可靠性與準確性的有效手段,但EQA得到的偏移是單次檢測結果與公議值的差值,中心組織的HCV RNA室間質(zhì)量評價也一直采用試劑組組內(nèi)公議值進行評價,其結果只能用于評價組內(nèi)不同實驗室間結果的一致性。不同組別之間的結果缺乏可比性,得出具有互換性和準確性的患者檢驗結果是臨床實驗室的重要目標[5]。正確度驗證計劃是EQA的一種特殊方式,是評價實驗室多次重復檢測結果的平均值與參考量值間的一致程度[6],“正確度”只能通過“溯源”來確定,所得偏移較室間質(zhì)評更可靠和準確。

    本研究分析了上海地區(qū)臨床實驗室2018年HCV RNA正確度驗證結果。根據(jù)CNAS-CL02-A009《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》中不精密度要求,以0.4 logIU/ml為允許總誤差,中間精密度<4/5Tea計算,2個樣本的CV應分別小于7.14%和5.79%,上報結果中實驗室8的CV超過了允許要求,但該實驗室2個樣本的檢測均值均在允許范圍內(nèi),提示實驗室檢測結果雖符合要求但檢測重復性不佳,存在隨機誤差,建議實驗室應加強人員培訓,同時建議實驗室應重新進行HCV RNA項目檢測系統(tǒng)的精密度驗證。另外,結果顯示實驗室9和實驗室13的低濃度樣本偏移超過了允許范圍,但兩個實驗室該濃度樣本的CV分別為1.91%和0.78%,提示兩家實驗室檢測重復性較好,表明實驗室存在系統(tǒng)誤差。建議實驗室可采取以下措施:①統(tǒng)計實驗室長期室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù),觀察近期是否存在系統(tǒng)偏倚趨勢;②上海地區(qū)室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)要求進行實驗室間比對,可通過室內(nèi)數(shù)據(jù)室間比對檢查實驗室檢測數(shù)據(jù)是否存在偏倚;③檢查實驗室檢測設備是否滿足要求;④從試劑校準品入手查找問題,積極聯(lián)系試劑廠家分析校準品溯源的正確性。調(diào)查數(shù)據(jù)還顯示2個樣本試劑組間最大差值分別為0.65 logIU/ml和0.55 logIU/ml,實驗室間最大差值分別為0.80 logIU/ml和0.63 logIU/ml,表明各試劑組和各實驗室間檢測結果還是存在一定差異,可能由于國內(nèi)HCV RNA檢測主要采用國產(chǎn)試劑,試劑品牌較多,各試劑校準品溯源方式不同,并且核酸提取以手工為主,整個檢測過程影響因素較多。

    綜上所述,上海地區(qū)大部分實驗室檢測重復性較好,正確度符合要求,但各試劑組和各實驗室之間結果存在差異。建議各試劑廠商統(tǒng)一試劑校準品的溯源方式和溯源鏈,并且積極推進全自動核酸提取系統(tǒng),使各實驗室之間的HCV RNA檢測結果更具可比性。

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