宮頸鱗癌患者癌組織Nemo樣激酶的表達與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系研究 *

蔣秋麗，王佩紅，苗群英，白 寧，樊陽陽

(1.漢中市中心醫(yī)院婦科，陜西漢中 723000；2.陜西省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710068)

宮頸癌是危害女性身心健康的重要疾病之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第二位[1]。每年在全球約有50萬新增宮頸癌患者，其中在中國新發(fā)病例約有13.15萬，占全球總發(fā)病人數(shù)的1/4[2]。根據(jù)組織病理特征，宮頸癌可以分為鱗狀細胞癌和腺癌，其中鱗狀細胞癌占宮頸癌全部組織類型的80%[3]。宮頸鱗癌5年生存率為70%[4]，嚴重威脅女性身體健康，并給患者帶來巨大經(jīng)濟負擔(dān)[5]。由于宮頸癌早期發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者就診時疾病已進展至晚期，因此尋找可以預(yù)示疾病進展的腫瘤標(biāo)志物對宮頸癌的防治意義重大，也是宮頸癌相關(guān)臨床研究的熱點。

Nemo樣激酶(nemo-like kinase，NLK)是絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，與胞外信號調(diào)節(jié)激酶及細胞周期蛋白依賴性激酶同源。有研究報道，NLK在肝癌、結(jié)腸癌及前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[6-8]。近年來，NLK與腫瘤細胞的增殖關(guān)系已成為腫瘤相關(guān)研究的熱點，但其在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的研究尚未見報道。因此，本次研究的目的是探索宮頸鱗癌患者癌組織Nemo樣激酶的表達與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，為宮頸鱗癌患者的診治及疾病預(yù)后的判斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 在2016年6月～2017年8月，共收集了172例于我院住院治療的宮頸鱗癌患者，所有病例均由病理診斷確診。所有納入患者均接受根治性子宮切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)，且在術(shù)前均未接受過任何形式的化療及放療，僅部分高?；颊呓邮芰诵g(shù)后放療。本研究中所有患者均按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會所推薦的標(biāo)準(FIGO)進行術(shù)前分期[9]，并收集相關(guān)的臨床資料。本研究納入的患者年齡32～70歲，平均年齡為51.24歲；所有患者均采取門診或電話的方式進行長期隨訪。本研究中所有患者的隨訪中位時間達64個月(16～82個月)。用于評價患者預(yù)后的總體生存時間(overall survival time，OS)定義為術(shù)后至患者死亡經(jīng)歷時間；無病生存時間(disease-free survival time，DFS)定義為手術(shù)成功完成至疾病復(fù)發(fā)所經(jīng)歷時間，患者是否復(fù)發(fā)均需影像學(xué)及病理學(xué)證據(jù)判斷。本次研究報經(jīng)本院倫理委員會審核批準，并且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 電泳槽，蛋白標(biāo)準品，Western雜交儀，硝化纖維素濾膜購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司；NLK抗體，鼠二抗購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 Western Blot將宮頸鱗癌病理組織置于RIPA緩沖液與1 mg/dl蛋白酶抑制劑混合溶液中4℃離心15 min。分離物采用雙鏈氨基酸蛋白試劑定量，隨后取30 μg蛋白質(zhì)跑SDS-PAGE，而后轉(zhuǎn)移至甲醇活化的硝化纖維素濾膜。然后加入NLK抗體(1∶1 000稀釋)在4℃的條件下孵育過夜。加入二抗在室溫下靜置1 h，隨后曝光顯影。

1.3.2 免疫組化：將患者的病理組織石蠟標(biāo)本切成4 μm的薄片并且用3 ml/dl的過氧化氫溶液在37 ℃的條件下處理30 min，隨后加入10 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)并置于高壓鍋中2 min。與小鼠抗人NLK單克隆抗體(1∶100稀釋)4℃條件下靜置過夜孵育。加入鼠二抗，室溫孵育20 min。隨后將切片浸泡在3，3-四鹽酸二氨基聯(lián)苯溶液中并用蘇木紫復(fù)染。通過結(jié)合顯微鏡下陽性腫瘤細胞的染色強度及陽性腫瘤細胞百分比來評估NLK的免疫反應(yīng)。染色結(jié)果由兩名10年以上病理科工作經(jīng)驗的執(zhí)業(yè)醫(yī)師獨立評價，當(dāng)結(jié)果不一致時由第三名讀片人員進行讀片以確定最終結(jié)果。本次研究中，兩位讀片人員的讀片結(jié)果一致率為97.67%。染色百分比按照0%(0分)，<5%(1分)，5%～50%(2分)和>50%(3分)的評分標(biāo)準進行；染色強度按照無染色(0分)，弱染色(1分)，中度染色(2分)和強染色(3分)的評分標(biāo)準進行[10]。本次研究染色總得分在0～6分之間，總得分介于0～3分則認為NLK弱表達；總得分在4～6分則認為NLK強表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析分類資料組間差異，定量資料則根據(jù)數(shù)據(jù)分布特征采用參數(shù)或非參數(shù)的方法分析組間差異。進一步采用Log-Rank檢驗比較不同組別患者總體生存時間(OS)及無疾病生存時間(DFS)的差異并繪制K-M生存曲線。應(yīng)用COX模型探索NLK表達對總體生存時間(OS)及無疾病生存時間(DFS)的影響，首先逐一納入不同臨床特征因素，在α=0.05的水平下可以確定三個宮頸鱗癌患者總體生存時間的影響因素，分別為NLK表達情況、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨后，將三個因素共同納入模型中，當(dāng)P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NLK表達情況與宮頸鱗癌患者臨床特征間的關(guān)系 見圖1?？梢钥闯鯪LK染色主要集中在腫瘤細胞的細胞核。所有腫瘤組織標(biāo)本中，有76例(44.19%)為NLK低表達；96例(55.81%)為高表達。39例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NLK處于高表達水平的有34例(87.18%)。

注：圖a為NLK在腫瘤組織中低表達時免疫組化染色結(jié)果；圖b為NLK在腫瘤組織中高表達時免疫組化染色結(jié)果；圖c為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中NLK高表達時免疫組化染色結(jié)果。

圖1宮頸鱗癌患者病理組織中NLK的表達情況

由表1可以看出，NLK的表達情況在不同年齡、不同F(xiàn)IGO分期、不同病理分級、不同腫瘤直徑及不同子宮旁組織累及狀態(tài)的人群間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而NLK的表達情況在不同血管/淋巴結(jié)浸潤狀態(tài)、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及不同腫瘤復(fù)發(fā)情況的人群間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同臨床特征研究對象NLK表達情況差異性分析[n=172，n(%)]

2.2 NLK表達與宮頸鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 見表2。NLK低表達水平的患者平均無疾病生存時間為76.41個月；NLK高表達水平的患者平均無疾病生存時間為53.24個月；Log-Rank檢驗結(jié)果提示NLK低表達水平患者與NLK高表達水平患者間無疾病生存時間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；NLK低表達水平的患者總體生存時間為76.41個月，NLK高表達水平的患者總體生存時間為56.05個月；Log-Rank檢驗結(jié)果提示NLK低表達水平患者與NLK高表達水平患者間總體生存時間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。見表3?？梢钥闯龌颊叩腘LK表達情況、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響患者總體生存時間的風(fēng)險因素。進一步進行患者無疾病生存時間的影響因素分析，可以看出患者的NLK表達情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響患者無疾病生存時間的危險因素。

圖2 NLK表達量對宮頸鱗癌患者總體生存時間以及無疾病生存時間的影響

表2 不同NLK表達情況患者生存時間差異性分析

表3 COX模型危險因素分析及因素HR估計

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，NLK的表達與患者淋巴/血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及疾病復(fù)發(fā)情況有密切關(guān)系；COX模型的結(jié)果同時表明NLK的表達情況是整體生存時間及無疾病生存時間的獨立影響因素?？傊?，本次研究發(fā)現(xiàn)NLK可以作為預(yù)示宮頸鱗癌患者進展及預(yù)后的指標(biāo)。通過對已有文獻的查閱可以發(fā)現(xiàn)，NLK的表達在不同類別腫瘤的細胞中不同。其中，NLK在60%～70%的COS7細胞及HEK293細胞中主要在細胞核中表達，在30%～40%的細胞中主要表達在細胞質(zhì)中[10]。分析鼻咽癌、肝細胞癌、膠質(zhì)瘤及膽囊癌的病理組織，發(fā)現(xiàn)NLK主要在細胞核表達，在直結(jié)腸癌中NLK主要表達在細胞質(zhì)[10-13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌患者中NLK的表達主要集中在細胞核。NLK在不同腫瘤細胞中表達位置的不同可能表明NLK在不同腫瘤中通過不同的信號傳導(dǎo)通路參與腫瘤細胞生理過程的調(diào)節(jié)。

有證據(jù)表明，NLK既是原癌基因又是抑癌基因，這主要與器官/細胞類型有關(guān)。一方面，NLK作為致癌基因，下調(diào)該基因的表達可能抑制癌癥的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)抑制NLK的表達可以減緩肝癌的細胞生長并增加負向調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達，達到延緩肝癌惡化的作用[14]；此外，下調(diào)NLK的表達可顯著降低膽囊癌細胞的增殖和遷移能力[11]。另一方面，NLK可通過抑制細胞增殖、遷移、侵襲或誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制癌癥的發(fā)展。上調(diào)NLK的表達可以抑制雄激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄并減少前列腺癌細胞PC-3的數(shù)量[8]。在人結(jié)直腸腺癌上皮細胞中NLK的過度表達可誘發(fā)細胞凋亡，抑制細胞增殖[15]。本次研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌病理組織中NLK的表達主要體現(xiàn)為致癌的作用，但還需進一步的細胞試驗加以證實，這也是下一步研究的方向。

總而言之，本次研究發(fā)現(xiàn)NLK的過度表達在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用并且與患者預(yù)后有密切的關(guān)系。NLK高表達水平的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險及死亡風(fēng)險均較高，這對宮頸鱗癌患者的隨訪、治療及預(yù)后的判斷有重要意義，這也進一步表明通過抑制NLK的過表達可能成為延緩宮頸鱗癌病程發(fā)展的方法。