高效液相色譜法測(cè)定自制紅曲米中麥角固醇的含量

李雨恒，孫曉東，劉潤(rùn)璞，楊靈絲

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600)

紅曲又稱(chēng)“丹曲”、“赤曲”，在我國(guó)已有一千多年的食用歷史，被廣泛應(yīng)用于釀酒、發(fā)酵、調(diào)味劑、著色劑和藥物等方面[1-3]。1979年日本遠(yuǎn)藤氏從紅曲中發(fā)現(xiàn)了可以抑制膽固醇合成的Monacolin K[4]，紅曲及其發(fā)酵產(chǎn)物漸漸走入人們的視線。此后研究發(fā)現(xiàn)紅曲具有抗菌抑菌、降血壓、防癌和防止佝僂病等多種功效[5，6]，更加被人們所關(guān)注。麥角固醇又名麥角甾醇，最早發(fā)現(xiàn)于小麥的寄生菌——麥角菌中，其含量與真菌生物量存在正相關(guān)，在紅曲米的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中可通過(guò)麥角固醇的含量來(lái)衡量發(fā)酵菌株的生物量[7，8]。麥角固醇經(jīng)紫外線照射可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D，促使老人與孕婦對(duì)鈣和磷的吸收，同時(shí)它用于可的松、激素黃體酮的生產(chǎn)，是重要的醫(yī)藥化工原料[9，10]。紅曲米固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生麥角固醇的適宜溫度為26～30 ℃，此時(shí)可得到較高的產(chǎn)量，而溫度的升高不利于真菌產(chǎn)麥角固醇[11]，因此本研究3種菌發(fā)酵自制紅曲米的溫度為28 ℃。本研究為篩選麥角固醇生產(chǎn)菌，提高紅曲米的藥用價(jià)值奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中的3株菌均為紫紅曲霉(Monascuspurpureus)，其中SD3分離自山東柿餅，F(xiàn)en和A13分離自丹東家庭自制豆醬。3株菌均于實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。

1.2 試劑

提取用無(wú)水乙醇、乙醚、氫氧化鈉：均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：上海源葉生物技術(shù)有限公司；液相用乙醇、甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司；泰國(guó)香米：購(gòu)于超市；水：超純水。

1.3 儀器設(shè)備

Agilent 1260 型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；XFH-75C電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；CP225D 型電子天平 德國(guó) Sartorius公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀 美國(guó)Millipore公司；101-3AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；HH-3D恒溫水浴鍋 上海儀純實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺(tái) 上海滬凈凈化設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將3株菌接種于PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)7 d。

1.4.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

制作種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g，蛋白胨25 g， NaNO32 g， MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4·3H2O 1 g，pH為5.5，121 ℃滅菌20 min。

將3株菌接入種子培養(yǎng)基中，28 ℃,180 r/min培養(yǎng)7 d。

1.4.3 紅曲米的制備

將從超市購(gòu)入的泰國(guó)香米浸泡過(guò)夜，瀝干水分，放入500 mL罐頭瓶中，每瓶100 g， 121 ℃滅菌60 min。超凈臺(tái)中加入20 mL液體發(fā)酵后的菌液，每種菌3個(gè)重復(fù)， 28 ℃黑暗培養(yǎng)15 d。

1.4.4 紅曲米的烘干

將自制紅曲米均勻平鋪于濾紙上，置于60 ℃烘干箱中4 h。將烘干后的紅曲米收集，碾碎保存。

1.4.5 麥角固醇樣品的制備

稱(chēng)取50 g NaOH于80 mL超純水中，用無(wú)水乙醇定容到200 mL，配制成堿乙醇溶液。精確稱(chēng)取0.5 g烘干后的紅曲米于比色管中，取16 mL堿乙醇加入到比色管中，放入85 ℃的恒溫水浴鍋中，皂化1.5 h后向其中補(bǔ)加乙醇至20 mL，繼續(xù)皂化1 h，取出，冷卻至室溫。加入10 mL乙醚并震蕩30 s，靜置40 min，用超純水水洗至中性，放入40 ℃的水浴鍋中將乙醚全部蒸干。向比色管中加入甲醇，使麥角固醇完全溶解，經(jīng)0.45 μm的膜微濾，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。

1.4.6 高效液相法檢測(cè)麥角固醇

1.4.6.1 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精確稱(chēng)取100 mg(精確到0.0001 g)標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇溶解，并定容至100 mL，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用儲(chǔ)備液配制10，100，500，1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 ℃保存。

1.4.6.2 色譜條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；色譜柱ZORBAXEclipse SB-C18(5，250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：甲醇；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：284.0 nm；進(jìn)樣量：20.000 μL。

1.4.6.3 麥角固醇含量的計(jì)算

式中：C為紅曲米中麥角固醇的含量，mg/g；C1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品濃度，μg/mL；V為皂化提取時(shí)加入甲醇的體積，mL；m為提取紅曲樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取上述配制的四種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，麥角固醇濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=0.1709x+0.3194，R2=0.9996。

圖1 麥角固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ergosterol

由圖1可知，麥角固醇在10～1000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 樣品中麥角固醇的含量

通過(guò)計(jì)算得出Fen、SD3和A13固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中麥角固醇的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中麥角固醇的含量Table 1 The content of ergosterol in the samples

由表1可知，A13和Fen固體發(fā)酵的狀態(tài)相近，兩株菌均來(lái)自于丹東家庭自制豆醬，發(fā)酵中產(chǎn)麥角固醇的含量高于來(lái)自山東柿餅的SD3。

3 討論

許莉等對(duì)山西康欣藥業(yè)有限公司的銀蜜片中的麥角固醇進(jìn)行測(cè)定，含量在0.015 mg/g左右浮動(dòng)[12]；來(lái)李娟等對(duì)山西云鵬制藥有限公司的猴頭菌片中的麥角固醇含量進(jìn)行測(cè)定，含量在0.26 mg/g左右浮動(dòng)[13]。這些藥品中均含有麥角固醇，其作用為降膽固醇、預(yù)防心腦血管疾病等，并廣泛存在于真菌子實(shí)體和發(fā)酵的菌絲中。檢測(cè)麥角固醇含量的方法主要有紫外分光光度法和高效液相色譜法。酵母在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物簡(jiǎn)單，故采用簡(jiǎn)單易行的紫外分光光度法；而紅曲霉代謝產(chǎn)物豐富而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，現(xiàn)基本采用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行含量的測(cè)定[14，15]。紅曲霉中許多菌株均能不同程度地產(chǎn)生麥角固醇[16]，本研究前期所獲得的3種紅曲霉麥角固醇的產(chǎn)量差異較大，其中Fen和A13均分離于丹東家庭自制豆醬，相同的分離基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的麥角固醇Fen卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A13，而分離自柿餅中的SD3產(chǎn)生極其微量的麥角固醇，說(shuō)明菌株間發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的能力存在著明顯的差異。麥角固醇作為新興的、重要的藥用物質(zhì)，已逐漸被人們所關(guān)注。朱效剛等利用紅曲菌SJS-20發(fā)酵，并對(duì)其產(chǎn)麥角固醇的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到麥角固醇的最高產(chǎn)量為8.1 mg/g[17]。研究獲得的紫紅曲霉Fen可以通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件和發(fā)酵基質(zhì)來(lái)提高麥角固醇的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

麥角固醇為安全無(wú)害的醫(yī)藥原料，具有降血壓、降血脂、預(yù)防骨質(zhì)疏松等重要的作用。本研究利用篩選到的紫紅曲霉Fen發(fā)酵制成紅曲米，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)，得到了含量相對(duì)較高的麥角固醇，研究為提高麥角固醇的產(chǎn)量，提高紅曲米的品質(zhì)和藥用價(jià)值奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。