基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討全石榴“助胃火” 治療功能性胃腸病的作用機(jī)制

李建良， 王朝魯， 蔡淑珍， 圖 雅

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京100102；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028000；4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心，北京100700）

全石榴為石榴科植物石榴Punica granarum L.的干燥成熟果實(shí)，蒙文名阿那爾，始載于《百方篇》，為巴達(dá)干病之貴藥，蒙醫(yī)藥理論認(rèn)為它具有助胃火、祛赫依巴達(dá)干、消食、開胃、止瀉功能，主治消化不良、巴達(dá)干病、惡心、肺赫依、肝赫依、腎赫依、寒性腹瀉、腹脹、噯氣等癥［1］。在2013 版的《傳統(tǒng)蒙藥與方劑》 記載的22 個(gè)祛巴達(dá)干方子中，有10 個(gè)蒙藥方使用了石榴。

功能性胃腸病是一種常見的反復(fù)發(fā)作的慢性胃腸道疾病，目前它沒有明顯病理改變和生化機(jī)制的解釋，約40%患者主要有不明原因的腹痛、腹脹、餐后飽腹、早飽、腹瀉、便秘等臨床表現(xiàn)。在胃腸道疾病患者中，有一半被診斷患有功能性胃腸?。?］，而功能性消化不良和腸易激綜合征被認(rèn)為是最常見的種類，在亞洲其患病率為5%～30%［3］，而在全世界范圍內(nèi)為9%～23%［4］，雖然它不會危及生命，但可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，并造成較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

國內(nèi)學(xué)者［5-7］陸續(xù)提出了中醫(yī)藥與網(wǎng)絡(luò)之間的假設(shè)，論述了計(jì)算機(jī)生物系統(tǒng)與中醫(yī)藥“整體、辨證” 觀念之間的關(guān)系，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度探討了單味中藥［8］、中成藥［9-10］等作用機(jī)制。在民族藥研究中，不少學(xué)者［11］提出了“互鑒互融” 的理念，借鑒中藥現(xiàn)代研究模式達(dá)到藥效物質(zhì)、作用機(jī)制、民族醫(yī)藥理論與經(jīng)驗(yàn)特征基本清楚的目的。本研究通過該方法，從整體上對全石榴“助胃火” 治療功能性胃腸病的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，也為后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 候選化合物獲取 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http： ／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）、 化 學(xué) 專 業(yè) 數(shù) 據(jù) 庫 （http： ／／www.organchem.csdb.cn／scdb／default.asp） 對全石榴化合物進(jìn)行搜集。再利用PubChem（https： ／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／） 數(shù)據(jù)庫，下載候選化合物的Sdf（*.sdf）格式文件，并轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES 格式保存。

1.2 活性化合物篩選 基于SwissADME 平臺來預(yù)測候選化合物吸收度和類藥性的相關(guān)參數(shù)，將“1.1” 項(xiàng)下sdf 格式文件上傳至Swiss ADME（http： ／／www.swissadme.ch／）平臺［12］。首先，設(shè)定腸胃吸收 （gatrointestinal absortion；GIabsortion） 為“High” 結(jié)果作為藥物可以被吸收的條件，用于篩選具有較好口服生物利用度的活性化合物；其次，設(shè) 定5 種 類 藥 性 預(yù) 測 （Lipinski、 Ghose、 Veber、 Egan、Muegge） 結(jié)果中有2 個(gè)及2 個(gè)以上為“Yes” 的化合物，即可作為活性化合物。

1.3 活性化合物靶點(diǎn)預(yù)測 將SMILES 格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction （http： ／／www.swisstargetprediction.ch／）平臺［13］，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，收集預(yù)測到的所有靶點(diǎn)，并對靶點(diǎn)進(jìn)行除重。

1.4 全石榴“助胃火” 潛在靶點(diǎn)搜集 以“functional gastrointestinal disorders” 為 關(guān) 鍵 詞， 通 過OMIM （http： ／／www.omim.org／）、 DisGeNET （http： ／／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／home ）、 DiGSeE （ http： ／／210.107.182.61／geneSearch／）、 GeneCard （http： ／／www.genecards.org／）4 個(gè)疾病靶點(diǎn)網(wǎng)站搜集功能性腸胃炎的基因，去除掉重復(fù)靶點(diǎn)基因，與“1.3” 項(xiàng)下靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得潛在靶點(diǎn)。

1.5 生物過程與通路富集分析 Metascape 平臺是一個(gè)基因注釋分析數(shù)據(jù)庫，不僅能提供全面的功能注釋，而且擁有數(shù)據(jù)庫更新及時(shí)、使用免費(fèi)、操作簡便等特點(diǎn)［14］。將潛在靶點(diǎn)放入Metascape 平臺，對全石榴潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 注釋分析及KEGG 通路分析，保存其結(jié)果，并通過Cytoscape3.5.1 和GraphPad Prism 7.0 軟件對結(jié)果可視化。

1.6 “活性成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將全石榴活性成分、潛在靶點(diǎn)、代謝通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.5.1 軟件，通過Merge 工具構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 活性成分 全石榴中富含多種化合物，主要為鞣質(zhì)、酚類、黃酮、花青素、生物堿、不飽和脂肪酸等?；赥CMSP、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫，通過篩選口服生物利用度、類藥性，最終獲得34 個(gè)具有較高活性的成分，見表1。

表1 全石榴活性成分

2.2 潛在靶點(diǎn) 基于Swiss Target Prediction 平臺得到524 個(gè)基因靶點(diǎn)， 刪除重復(fù)項(xiàng)后得到216 個(gè)。 通過與DisGeNET、OMIM、DiGSeE 疾病數(shù)據(jù)庫中功能性腸胃病的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對，最終篩選出86 個(gè)潛在靶點(diǎn)，見表2。

2.3 基因功能和通路富集分析

2.3.1 GO 注釋分析 GO 注釋分析由分子功能（molecular function）、 生 物 過 程 （biological process）、 細(xì) 胞 組 成（cellular component）3 個(gè)部分組成，共同描述基因生物學(xué)功能。將全石榴抗功能性胃腸病的86 個(gè)靶點(diǎn)上傳到Metascape 平臺，設(shè)置閾值P＜0.01，minimum count 3、enrichment factor＞1.5，共收集到314 條BP 條目、140 條MF 條目、59條CC 條目。由于BP、MF 條目數(shù)量較多，故Metascape 平臺通過Kappa scores 作為相似性參數(shù)，將相似性＞0.3 的條目進(jìn)行分層聚類分析，并采用Cytoscape3.5.1 軟件繪制富集分析聚類網(wǎng)絡(luò)圖（圖1 A ～1B），每個(gè)條目由節(jié)點(diǎn)表示，圓形大小與輸入基因的數(shù)量成正比，而相同顏色的節(jié)點(diǎn)屬于同一簇，每一簇當(dāng)中選擇P 值作為代表展示在右下角。具有相似性得分＞0.3 的條目由邊連接，邊的粗細(xì)表示相似性得分的高低，而細(xì)胞組分的可視化則采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制其熱圖（圖1C）。

全石榴活性靶點(diǎn)的BP 富集結(jié)果顯示，大部分與鈣離子 （Ca2＋） 調(diào) 節(jié) 相 關(guān) （calcium ion transport、 positive regulation of cytosolic calcium ion concentration、 cellular calcium ion homeostasis 等）；MF 富集分析也提示，全石榴活性靶點(diǎn)與離子通道活性相關(guān)（calcium channel activity、ion channel activity、cation channel activity 等）。大量研究表明，Ca2＋在介導(dǎo)胃腸道平滑肌收縮反應(yīng)中起核心作用，而平滑肌收縮和舒張是維持消化功能的基礎(chǔ)；其次，BP 富集結(jié)果還聚焦于神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)程相關(guān)（regulation of neurotransmitter levels、 neurotransmitter metabolic process、 neurotransmitter biosynthetic process、 neurotransmitter catabolic process等）?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腸神經(jīng)系統(tǒng)能夠控制腸胃腸道運(yùn)動、分泌、血流、水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能［15］，而靶點(diǎn)富集結(jié)果提示，全石榴能通過離子調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)等調(diào)控胃腸道的正常功能，這與傳統(tǒng)蒙醫(yī)認(rèn)為全石榴具有“助胃火” 功效來進(jìn)一步行使胃部的正常功能不謀而合。此外，MF 富集結(jié)果還提示， 全石榴與蛋白激酶活性相關(guān) （protein kinase activity、 protein serine／threonine kinase activity、 protein kinase binding、protein kinase C activity 等）；CC 分析結(jié)果顯示，活性靶點(diǎn)的細(xì)胞組分多種多樣（圖1C），以神經(jīng)突出和膜系統(tǒng)為主。

表2 全石榴潛在靶點(diǎn)

2.3.2 KEGG 通路富集分析 通過Metascape 平臺將全石榴活性靶點(diǎn)進(jìn)行富集，共獲得103 條KEGG 信號通路，篩選出21 條直接跟胃腸道疾病相關(guān)的信號通路，采用Graph-Pad Prism 7.0 軟件對其結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖2。信號通路包括信號分子的相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway）、神經(jīng)遞質(zhì)（Serotonergic synapse、 Cholinergic synapse）、 脂代謝 （Arachidonic acid metabolism）、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) （Calcium signaling pathway、VEGF signaling pathway）、 細(xì) 胞 增 殖 和 死 亡 相 關(guān) （Cell cycle、p53 signaling pathway、Apoptosis）、免疫系統(tǒng)相關(guān)（IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Leukocyte transendothelial migration、Inflammatory mediator regulation of TRP channels）、消化系統(tǒng)相關(guān)（Gastric acid secretion）、循環(huán)系統(tǒng)（Vascular smooth muscle contraction）、細(xì)胞運(yùn)動（Regulation of actin cytoskeleton）。

2.4 “活性成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò) 將全石榴活性成分、作用靶點(diǎn)、KEGG 通路信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，見圖3。若某一靶點(diǎn)為活性化合物的潛在靶點(diǎn)，則以邊相連，若某一蛋白對某條通路具有調(diào)節(jié)作用，也通過邊連接。從圖中可以看出全石榴同一活性成分對應(yīng)多個(gè)作用靶點(diǎn)和全石榴的多個(gè)活性成分對應(yīng)同一靶點(diǎn)的“一對多” 和“多對一” 作用關(guān)系，體現(xiàn)了全石榴多成分、多靶點(diǎn)治療功能性胃腸病的作用特點(diǎn)。

3 討論

蒙醫(yī)藥作為我國四大民族醫(yī)藥之一，是蒙古游牧民族同疾病抗?fàn)幾钣辛Φ奈淦鳌Ｃ舍t(yī)認(rèn)為，人體由三根（ “赫依” “希拉” “巴達(dá)干” ） 和七素（食物精華、血、肉、脂、骨、骨髓、精液） 組成，早在《四部甘露》 中就將胃比喻成鍋，認(rèn)為它是作為容納食物的六腑中的第一大腑，食物精華的生成是人體進(jìn)行新陳代謝的基礎(chǔ)，消化吸收主要靠胃的火溫完成，七素功能均要在三根作用下靠火溫來完成，可見胃在維持人體功能的重要性。

三根中“巴達(dá)干” 偏盛將導(dǎo)致三根失調(diào)，機(jī)體清濁生活的功能紊亂，是一切寒性疾病的內(nèi)因，治療原則應(yīng)以溫性藥助長胃火，清除“巴達(dá)干”。蒙醫(yī)認(rèn)為，全石榴味酸、甘，性熱、銳、糙、動、膩、燥、輕，具有調(diào)理胃火、祛“巴達(dá)干” 寒癥、消食、開胃、止瀉的功效，能“助胃火”而驅(qū)除巴達(dá)干，恢復(fù)胃的火溫而使其功能正常，臨床上常配伍熱性藥以治療消化不良、胃寒、惡心、胃腸脹鳴、腹瀉等寒性“巴達(dá)干” 病癥；現(xiàn)代研究表明，石榴皮醇提物能緩解乙醇造成的實(shí)驗(yàn)性胃黏膜損傷，促進(jìn)胃黏液分泌，保護(hù)黏膜完整，從而治療實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍［16-18］，其水提物對幽門螺桿菌甲硝唑耐藥株、敏感株有體外抑制作用［19］，而石榴籽提取物能止瀉［20］，同時(shí)還可調(diào)節(jié)胃平滑肌的收縮增強(qiáng)胃功能［21］。

圖1 GO 注釋分析圖

圖2 KEGG 富集分析圖

圖3 全石榴“活性成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)

GO 注釋分析和靶點(diǎn)功能分析發(fā)現(xiàn)，全石榴治療功能性胃腸病主要與配體受體結(jié)合、Ca2＋轉(zhuǎn)運(yùn)、離子通道進(jìn)程、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生物過程相關(guān)，涉及細(xì)胞膜、神經(jīng)元突觸、離子通道等多種物質(zhì)，參與離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、離子通道活性等分子過程。Pathway 分析發(fā)現(xiàn)，全石榴活性靶點(diǎn)涉及Neuroactive ligand-receptor interaction、Serotonergic synapse、Cholinergic synaps、Calcium signaling pathway、VEGF signaling pathway、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、 T cell receptor signaling pathway、Leukocyte transendothelial migration、 Inflammatory mediator regulation of TRP channels 等通路與信號分子的相互作用，神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，免疫炎癥相關(guān)，Gastric acid secretion 通路，能直接影響胃酸分泌。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，壁內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)、胃平滑肌、間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了胃運(yùn)動功能的基本單元，其功能異常是造成胃動力障礙、功能性胃腸疾病的重要原因，許多神經(jīng)遞質(zhì)參與了致敏神經(jīng)元，導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性在腸易激綜合征中起到著重要作用［22］，同時(shí)也與功能性消化不良時(shí)飯后胃痛、打嗝等癥狀相關(guān)。5-羥色胺（5-HT） 是參與調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其系統(tǒng)異?？蓪?dǎo)致胃腸動力及分泌功能異常、內(nèi)臟高敏感性，與功能性胃腸病癥狀密切相關(guān)［22-23］。

本研究發(fā)現(xiàn)，石榴在治療功能性胃腸病過程中與多種神經(jīng)遞質(zhì)傳遞調(diào)節(jié)相關(guān)。常見的功能性胃腸病均伴隨黏膜炎癥，如功能性消化不良患者胃竇和十二指腸黏膜、腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜均有炎癥，其中前者又存在胃竇和十二指腸運(yùn)動紊亂，從而進(jìn)一步激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫，導(dǎo)致黏膜炎癥［24］。Meenakshi 等［25-26］報(bào)道，石榴果實(shí)能通過抑制促炎物質(zhì)（iNOS、COX-2、IL-6［27］等） 表達(dá)，進(jìn)一步下調(diào)PGE2、NO 生成，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用；石榴皮醇提物可降低胃黏膜炎性因子 （MPO、 TNF-α、 IL-1β） 和VEGF 水平，進(jìn)一步抑制潰瘍發(fā)生［28］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，功能性胃腸病是“神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌” 失調(diào)所致［29］。本研究結(jié)果顯示，全石榴“助胃火” 治療功能性胃腸病也涉及了神經(jīng)系統(tǒng)（Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、regulation of neurotransmitter levels、neurotransmitter metabolic process、 neurotransmitter biosynthetic process、neurotransmitter catabolic process）、免疫系統(tǒng)（IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、 Leukocyte transendothelial migration、 Inflammatory mediator regulation of TRP channels）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（Serotonergic synapse、Cholinergic synapse、Arachidonic acid metabolism）3 個(gè)方面，進(jìn)一步證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在蒙藥全石榴治療功能性胃腸病的機(jī)制預(yù)測的可行性，但其具體靶點(diǎn)和通路還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從全石榴34 個(gè)化合物、86 個(gè)靶點(diǎn)出發(fā)，建立成分-靶點(diǎn)-通路的生物網(wǎng)絡(luò)，從整體上為該藥材“助胃火” 提高胃腸道功能，治療功能性胃腸病的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，也為其他民族藥相關(guān)研究提供借鑒。