不同采收期江枳實(shí)揮發(fā)性成分的GC-MS 指紋圖譜

鄧可眾， 陳 虹， 葛 菲， 熊 英*， 危先文

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004；2.梅州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 梅州514011）

枳實(shí)是常用的理氣類中藥之一，為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck 的干燥幼果，市場(chǎng)上藥材來源多以酸橙為主。江西的酸橙植物資源極其豐富，江枳實(shí)為贛產(chǎn)道地藥材，每年5 ～6 月收集自落的酸橙幼果入藥。藥材采收期是影響中藥質(zhì)量的重要因素之一，圍繞枳實(shí)所含非揮發(fā)性成分如生物堿、黃酮類成分的分析檢測(cè)已有較多報(bào)道［1-6］。枳實(shí)中也含有大量的揮發(fā)性成分，通常以檸檬烯的含有量較高［7-9］，并且揮發(fā)油、檸檬烯具有促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)、抗菌等活性［10-16］。雖對(duì)枳實(shí)揮發(fā)油的GC 指紋圖譜已有相關(guān)研究［17］，尚未見采用指紋圖譜對(duì)不同采收期枳實(shí)中揮發(fā)性成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析的報(bào)道，GC-MS 聯(lián)用技術(shù)為研究中藥材揮發(fā)性成分提供便捷方法，課題組利用GC-MS 建立江枳實(shí)揮發(fā)性成分的指紋圖譜，對(duì)16 批次不同采收期江枳實(shí)中揮發(fā)性成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，以期為江枳實(shí)最佳采收時(shí)間的優(yōu)選提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 儀器Agilent7890AGC-Agilent5975CMS聯(lián)用儀 （美國(guó)Agilent 公司）， 質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫NIST11.L；XS3DU 電子分析天平（百萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；BS 224S 電子分析天平（萬分之一，德國(guó)Sartorius 公司）。

1.2 材料 據(jù)產(chǎn)地調(diào)查酸橙于5 月中旬開始落花結(jié)果，生長(zhǎng)至6 月底7 月初時(shí)的未成熟果實(shí)則作為枳殼藥用，故江枳實(shí)的采集時(shí)間分別為2014年的5 月21 日、6 月1 日、6 月11 日、6 月21日，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果，信息見表1。

檸檬烯（批號(hào)H11M6Q1，含有量≥98%） 購于上海源葉生物科技有限公司；正己烷（分析純，西隴化工有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取檸檬烯對(duì)照品溶于正己烷中，配制成質(zhì)量濃度為94.80 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 揮發(fā)油提取 取枳實(shí)粉末（過3 號(hào)篩）20 g，加8 倍水，并在揮發(fā)油提取器上加2 mL 正己烷，加熱提取5 h，冷卻1 h，收集含揮發(fā)油的正己烷層，用1 mL 正己烷潤(rùn)洗揮發(fā)油提取器，合并正己烷溶液，用適量無水硫酸鈉靜置脫水12 h，取出正己烷溶液并定容至10 mL。

2.2 分析條件 Agilent HP-5MS 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比1 ∶10；載氣氦氣；程序升溫（初始60 ℃，以2 ℃／min 速率升到80 ℃，再以3 ℃／min速率升到100 ℃，保持1 min，再以5 ℃／min 速率升到180 ℃，保持1 min，最后以6 ℃／min 速率升到260 ℃）；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m／z 45～550。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一江枳實(shí)樣品（S5），在“2.2” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 針，檸檬烯（2 號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得18 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD 均小于0.40%。表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一江枳實(shí)樣品6 份（S5），按“2.1” 項(xiàng)下方法制備樣品，在“2.2”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣，檸檬烯為參照峰，測(cè)得18個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 小于1.17%，相對(duì)峰面積RSD 小于3.14%。 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一江枳實(shí)樣品（S5），在“2.2” 項(xiàng)條件下， 分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，檸檬烯為參照峰，測(cè)得18 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 小于0.06%，相對(duì)峰面積RSD小于2.92%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 4 個(gè)產(chǎn)地不同采收期的16批樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A 版，中位數(shù)法計(jì)算相似度，時(shí)間窗0.5，校準(zhǔn)后得16 批樣品揮發(fā)性成分的GC-MS 指紋圖譜見圖1，對(duì)照譜圖見圖2，共檢識(shí)得到相對(duì)含有量較高的18 個(gè)共有特征峰。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 相似度分析 結(jié)果見表1，新干三湖鎮(zhèn)6月上旬及樟樹昌傅鎮(zhèn)5 月下旬采收的S6、S13 號(hào)江枳實(shí)的相似度分別為0.861、0.875，其余樣品均大于0.9，表明不同采收期江枳實(shí)的總體相似度較高；并且來自同一采集地點(diǎn)但不同采收期樣品的相似度均以6 月中下旬的更高，故而從揮發(fā)性成分來看，以6 月中下旬采集的江枳藥材質(zhì)量的均一性相對(duì)較好。

表1 16 批樣品相似度Tab.1 Similarities of sixteen batches of samples

圖1 16 批樣品揮發(fā)性成分GC-MS 指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprints of volatile components in sixteen batches of samples

圖2 16 批樣品揮發(fā)性成分GC-MS 對(duì)照?qǐng)D譜Fig.2 GC-MS reference spectrum of volatile components in sixteen batches of samples

2.5.2 共有峰分析 根據(jù)質(zhì)譜庫檢索鑒定（匹配度＞90%） 共有峰成分名稱及相關(guān)特征參數(shù)見表2，其中，包括6 個(gè)單萜烯類、6 個(gè)倍半萜烯類、4 個(gè)單萜醇及2 個(gè)酯類成分，16 批樣品中各共有峰的面積歸一化相對(duì)百分含有量見表3。所有樣品中均以檸檬烯相對(duì)含有量為最高（15.0%～40.0%）、其 次 芳 樟 醇 （8.1% ～25.8%）、 大 根 香 葉 烯（7.9%～15.9%） 的含有量較高。同一采集地4 個(gè)不同采收期進(jìn)行比較，可以明顯看出主成分檸檬烯的相對(duì)含有量隨果實(shí)生長(zhǎng)、成熟度增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，見圖3。

圖3 16 批樣品中檸檬烯相對(duì)含有量變化Fig.3 Variation tendency of relative content of limonene in sixteen batches of samples

表2 各樣品中共有的揮發(fā)性特征成分Tab.2 Common volatile components of various samples

表3 16 批樣品共有峰成分相對(duì)含有量（%）Tab.3 The relative content of common components in sixteen batches of samples（%）

3 討論

對(duì)枳實(shí)揮發(fā)性成分的提取比較了水蒸氣蒸餾提取與溶劑提取法，其中溶劑提取法考察了乙醚和石油醚（30～60 ℃）2 種溶劑以及超聲與回流2 種方法。結(jié)果表明超聲與回流提取無明顯差異，提出揮發(fā)油的含有量與種類相差不大，乙醚與石油醚的提取率也無明顯差異，水蒸氣蒸餾與溶劑提取法均能獲得低沸點(diǎn)的揮發(fā)油，但溶劑提取法可同時(shí)提出較多高沸點(diǎn)、非揮發(fā)性成分，即便升溫達(dá)300 ℃，高沸點(diǎn)化合物仍沒有檢測(cè)完全，故而選擇水蒸氣蒸餾提取。因提取后水、油分離不便，故在揮發(fā)油提取器上端加入適量正己烷，并考察提取時(shí)間3、4、5、6 h 對(duì)提取率的影響，進(jìn)樣分析發(fā)現(xiàn)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，各成分含有量逐步增加，5 h 提取率可達(dá)6 h 的95%，故選擇5 h。

不同采收期江枳實(shí)藥材中所含揮發(fā)性成分的種類類似，但在相對(duì)含有量上有較大差異。來自同一采集地點(diǎn)、不同采收期江枳實(shí)的相似度均以6 月中下旬的更高，且檸檬烯亦以6 月中下旬的相對(duì)含有量較高。課題組前期進(jìn)行了江枳實(shí)的UPLC 指紋圖譜研究［18］，不同產(chǎn)地及不同采收期江枳實(shí)所含非揮發(fā)性成分亦十分相似，含有量以6 月中旬為最高，然而生長(zhǎng)至6 月下旬的果實(shí)進(jìn)一步膨大通常產(chǎn)量相對(duì)更高，綜合分析兩類成分的動(dòng)態(tài)變化及產(chǎn)量，建議6 月中下旬為最佳采收期。