異葉敗醬化學(xué)成分及其生物活性

王雅婧， 穆麗華， 劉 屏*

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619；2.中國人民解放軍總醫(yī)院藥理藥學(xué)研究室，北京100853）

異葉敗醬Patrinia heterophylla Bunge 是敗醬科敗醬屬多年生草本植物，其根莖或根與糙葉敗醬的根莖或根混用，藥材名墓頭回［1］。文獻(xiàn)報(bào)道墓頭回對(duì)各類急慢性白血病細(xì)胞有抑制作用，并且臨床上用于治療白血?。?-3］。異葉敗醬作為墓頭回的藥源植物，對(duì)其化學(xué)成分報(bào)道較少，為進(jìn)一步明確異葉敗醬中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)異葉敗醬進(jìn)行化學(xué)成分研究，并對(duì)其單體化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選。從中分離得到7 個(gè)化合物，化合物2 ～6 均為首次從該屬植物中分離得到，化合物1 為首次從該植物中分離得到，化合物1 ～6 對(duì)白血病細(xì)胞有一定的抑制作用。

1 儀器與材料

高效 液 相 色 譜 儀 （日 本 Hitachi 公 司）；2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器（美國Altech 公司）；R1-102 示差檢測器（日本Shodex 公司）；NP7000半制備液相泵（漢邦公司）；R200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、中壓反相色譜柱（瑞士Buchi 公司）；Bruker AV-ⅢHD 600 超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；Q-TOF 高分辨質(zhì)譜儀（美國Sciex 公司）；YT-CJ-1ND 超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆技術(shù)有限公司）；MCO-15ACCO2 恒溫培養(yǎng)箱 （日本Sanyo 公司）；DT5-2 離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；1420-012 酶標(biāo)儀 （美國Perkin Elmer 公司）； ECLIPSE TS100 顯微鏡（日本Nikon 公司）；D-101大孔樹脂（天津南開和成科技有限公司）；薄層層析硅膠GF254、柱層析硅膠100 ～200 目（青島海洋化工廠）。分析純石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈公司）。RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（美國HyClone 公司）；二甲基亞砜（美國Amresco公司）；CCK-8 試劑盒（Biosharp 生物科技公司）。

異葉敗醬于2014 年采于河南省，經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院劉萍研究員鑒定為正品。

人早幼粒白血病細(xì)胞（HL-60）、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（K562） 均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞中心。

2 提取與分離

干燥的異葉敗醬全草（2 kg） 粉碎，75%乙醇回流提取3 次，過濾后減壓濃縮得異葉敗醬總浸膏。總浸膏加水成懸浮液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，取有機(jī)相層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收溶劑，分別得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位63、112、36、95 g。取正丁醇部分用大孔樹脂色譜進(jìn)行分離，依次用30%、60%、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，減壓濃縮后得到30%、60%、95%部分浸膏。

將30%部分浸膏（50 g） 經(jīng)硅膠柱（100 ～200目） 分離，以氯仿-甲醇-水（25 ∶1 ∶0、9 ∶1 ∶0、9 ∶1 ∶0.1、8 ∶2 ∶0.2、7 ∶3 ∶0.5） 梯度洗脫，共得到263 個(gè)餾分A1-263，通過薄層色譜檢測，合并相同餾分。餾分A180-190合并后經(jīng)硅膠柱，以氯仿-甲醇-水（9 ∶1 ∶0.1、8 ∶2 ∶0.2） 梯度洗脫，再經(jīng)半制備HPLC （乙腈-水2 ∶8） 得化合物1（21.5 mg）。餾分A120-159合并后經(jīng)中壓反相柱以乙腈-水（1 ∶9、3 ∶17、1 ∶4、1 ∶3、3 ∶7） 梯度洗脫，得化合物2（12.1 mg）。

將60%部分的浸膏經(jīng)硅膠柱色譜（100 ～200目） 分離，經(jīng)氯仿-甲醇-水（9 ∶1 ∶0.1、8 ∶2 ∶0.2、7 ∶3 ∶0.5） 梯度洗脫，共得到245 個(gè)餾分B1-245，通過薄層色譜檢測，合并相同餾分。餾分B93-100合并后經(jīng)中壓反相柱以甲醇-水 （5 ∶95 ～55 ∶45） 梯度洗脫得化合物3 （11 mg）。 餾分B60-70號(hào)合并后經(jīng)中壓反相柱以乙腈-水（3 ∶97 ～48 ∶52） 梯度洗脫，F(xiàn)23 重結(jié)晶得化合物4（16.4 mg），F(xiàn)26 重結(jié)晶得化合物5 （9.1 mg）。 餾分B77-91號(hào)合并后經(jīng)中壓反相柱以甲醇-水（5 ∶95 ～80 ∶20） 梯度洗脫，F(xiàn)30 重結(jié)晶得化合物6（8.8 mg），F(xiàn)40 重結(jié)晶得化合物7（10.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（甲醇）。ESI-MS m／z：485［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：1.78（1H，m，H-13），2.03（2H，m，H-6），2.13（1H，m，H-9），2.19（2H，dd，J ＝7.2 Hz，H-12），2.95（1H，q，J ＝7.8 Hz，H-8），3.15（1H，t，J ＝8.4 Hz，H-7），3.24（2H，m，H-10），4.04（1H，d，J ＝11.4 Hz，H-1），4.22（1H，m，H-11）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：93.5（C-1），140.0（C-3），116.4（C-4），34.1（C-5），40.9（C-6），73.3（C-7），49.0（C-8），42.7（C-9），62.2（C-10），69.6（C-11），103.4（C-1′），75.1（C-2′），78.1（C-3′），71.7（C-4′），77.9（C-5′），62.8（C-6′），173.3（C-1″），44.1（C-2″），26.8（3″），22.6（4″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［4］ 一致， 故鑒定為patrinoside。

化合物2：黃色粉末（甲醇）。ESI-MS m／z：677［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：2.10（1H，d，J ＝16.8 Hz，H-2），2.47（1H，d，J ＝16.8 Hz，H-2），5.81（1H，quin，H-4），4.36（1H，m，H-9），1.21（3H，d，J ＝6.6 Hz，H-10），0.90（3H，s，H-11），0.91（3H，s，H-12），1.86（3H，d，J ＝1.2 Hz，H-13），4.28（3H，d，J ＝7.8 Hz，Glu-1′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：42.4（C-1），50.6 （C-2），201.1 （C-3），127.1 （C-4），167.2（C-5），79.9（C-6），131.5（C-7），135.2（C-8），77.2（C-9），21.1（C-10），23.4（C-11），24.6（C-12），19.5（C-13），102.7（C-1′），75.2（C-2′），78.1（C-3′），71.6（C-4′），77.9（C-5′），62.8（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］ 一致，故鑒定為roseoside Ⅱ。

化合物3：白色粉末（甲醇）。ESI-MS m／z：951［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：3.06（1H，dd，J ＝4.8 Hz，H-3），5.20（1H，brs，H-12），4.21（1H，d，J ＝8.4 Hz，H-Ara-1），4.29（1H，d，J ＝8.4 Hz，H-Glu-1′），5.30（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-Glu-1）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：39.8（C-1），27.0（C-2），90.7（C-3），40.1（C-4），57.0（C-5），19.3（C-6），33.9（C-7），40.7（C-8），49.0（C-9），37.9（C-10），24.5（C-11），123.8（C-12），144.8（C-13），42.8（C-14），28.9（C-15），24.0（C-16），49.0（C-17），41.8（C-18），41.4（C-19），36.7（C-20），29.2（C-21），32.4（C-22），28.5（C-23），16.9（C-24），16.1（C-25），17.8（C-26），26.3（C-27），178.0（C-28），74.3（C-29），107.1（C-Ara-1），78.1（C-Ara-2），72.8（C-Ara-3），69.5（C-Ara-4），66.3（CAra-5），95.7（C-Glu-1），73.8（C-Glu-2），78.0（C-Glu-3）， 70.9 （C-Glu-4）， 78.0 （C-Glu-5），69.5（C-Glu-6），104.6（C-Glu-1′），75.4（C-Glu-2′），78.0（C-Glu-3′），71.5（C-Glu-4′），77.8（CGlu-5′），62.7（C-Glu-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］一致，故鑒定為（3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl-（1 →6） -β-D-glucopyranoside。

化合物4：黃色晶體（DMSO）。ESI-MS m／z：455［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：7.95（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2′，6′），6.93（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3′，5′），6.82（1H，s，H-3），5.06（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-Glu-1），3.76（1H，s，H-Glu-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：182.0（C-4），164.2（C-7），162.9（C-2），161.4（C-4′），161.1（C-9），156.9（C-5），128.6（C-2′，C-6′），121.0（C-1′），116.0 （C-3′， C-5′），105.3 （C-10），103.1（C-3），99.9（C-Glu-1），99.5（C-6），94.8（C-8），77.2（C-Glu-3），76.4（C-Glu-5），73.1（C-Glu-2），69.5（C-Glu-4），60.6（C-Glu-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 一致，故鑒定為apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物5：白色針晶（DMSO）。ESI-MS m／z：483［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：5.00（1H，m，H-10），4.78（1H，s，H-10），4.58（1H，s，H-1″），4.35（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-3），4.23（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-1′），2.42（1H，t，J ＝5.4 Hz，H-1），2.28（1H，m，H-7），1.63（1H，d，J ＝9.6 Hz，H-7），2.12（1H，m，H-4），1.95（1H，overlap，H-4），1.23（3H，s，H-8），0.61（3H，s，H-9）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：150.8（C-2），113.4（C-10），101.1（C-1′），100.9（C-1″），76.6（C-3′），75.2（C-5′），73.3（C-2′），71.8（C-3），70.7（C-4′），70.5（C-3″），70.3（2″），68.3（C-5″），67.2（C-6′），50.0（C-1），40.3（C-6），39.9（C-5），31.9（C-4），26.8（C-7），25.8（C-8），21.9（C-9），17.9（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 一致，故鑒定為fissoside B。

化合物6：黃色晶體（DMSO）。ESI-MS m／z：577［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：1.07（3H，d，J ＝6.0 Hz，H-6?），4.54（1H，d，J ＝6.0 Hz，H-1?），5.06（1H，d，J ＝7.2 Hz，H-1″），6.44（1H，s，H-6），6.76（1H，s，H-8），6.85（1H，s，H-3），6.95（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3′，H-5′），7.95（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2′，H-6′），10.37（1H，s，4′-OH），12.95（1H，s，5′-OH）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：17.8（C-6?），66.0（C-6″），68.3（C-5?），69.5（C-2?），70.3（C-3?），70.7（C-4″），72.0（C-2″），73.1（C-4?），75.6（C-3″），76.3（C-5″），94.8（C-8），99.5（C-6），99.9（C-1?），100.5（C-1″），103.1（C-3），105.4（C-10），116.1（C-3′），121.0（C-1′），128.6（C-2′，C-6′），156.9（C-9），161.2（C-4′），161.3（C-7），162.9（C-5），164.4（C-2），182.0（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［9］ 一 致， 故 鑒 定 為 芹 菜 素-7-O-β-D-蘆 丁糖苷。

化合物7：黃色晶體（甲醇）。ESI-MS m／z：807［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：3.83（3H，s，H-7），5.01（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-1″），6.29（1H，d，J ＝7.2 Hz，H-6），6.55（1H，s，H-8），6.83（2H，d，J ＝9.0 Hz，H-3′，H-5′），8.07（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2′，H-6′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD） δ：179.7 （C-4），167.4 （C-7），162.7（C-5），161.8（C-4′），159.7（C-9），158.5（C-2），135.9（C-3），132.6（C-2′，C-6′），122.5（C-1′），116.2（C-3′），106.5（C-10），105.5（C-1″），104.0（C-1″″），101.9（C-1?），99.2（C-6），93.3（C-8），79.6（C-4?），75.4（C-5″），75.0（C-3″），74.0（C-4″″），73.2（C-3″″），73.0（C-2″″），72.2（C-2″），72.1（C-3?），71.9（C-2?），70.2（C-5″″），70.0（C-5?，C-4″），67.6（C-6″），56.6（C-OMe），18.0（C-6″″），18.0（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［10］ 一致， 故鑒定為rhamnocitrin 3-O-［ α-L-rhamnopyranosyl （ l → 4 ） -O-α-Lrhamnopyranosyl（1→6） ］ -β-D-galactopyranoside。

4 活性測試

4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞從液氮罐中取出，常規(guī)方法［11-12］復(fù)蘇，將細(xì)胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。根據(jù)不同細(xì)胞的生長速度1 ～2 d 更換新鮮的培養(yǎng)液或者傳代。

4.2 CCK-8 檢測 將處于對(duì)數(shù)生長期的HL-60、K562 細(xì)胞制成密度9×104／mL、8×104／mL 的細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)置5個(gè)平行孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分別加入不同質(zhì)量濃度的化合物1 ～6（從低到高依次為0、20、40、60、80、 100 μg／mL） 及 陽 性 對(duì) 照 品 順 鉑50 μL。給藥后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。1～2 h（K562 1.5 h，HL-60 2 h） 后在450 nm 處測OD 值。并計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50值。

4.3 對(duì)白血病細(xì)胞增殖抑制活性測定 各化合物的IC50值見表1。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［13］，單體化合物的IC50＜100 μg／mL，表明實(shí)驗(yàn)樣品具有明顯的細(xì)胞毒活性。結(jié)果顯示，化合物1～3、5 ～6 對(duì)HL-60細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用，化合物2 ～6 對(duì)K562 細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用。

5 討論

異葉敗醬是墓頭回最早的藥源植物［14］，是歷代本草中以墓頭回使用的主流，但是關(guān)于異葉敗醬的化學(xué)成分報(bào)道卻很少，目前國內(nèi)外有12 個(gè)三萜類、5 個(gè)環(huán)烯醚萜酯、3 個(gè)木脂素、2 個(gè)甾體類、3個(gè)黃酮類、1 個(gè)多糖和1 個(gè)香豆素類化合物的報(bào)道。異葉敗醬總皂苷和粗制劑可用于治療急慢性白血病、子宮癌、宮頸癌和大腸癌［15］，但是其發(fā)揮藥效的確切化合物尚未確定。本研究從異葉敗醬中分離得到7 個(gè)化合物，其中化合物1 為環(huán)烯醚萜類、化合物2 為單環(huán)降倍半萜苷類、化合物3 為三萜皂苷類、化合物5 為單萜類龍腦苷、化合物4、6～7 為黃酮類。通過CCK-8 法篩選了化合物1 ～6對(duì)HL-60 和K562 細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，各單體化合物對(duì)白血病細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用，且化合物1 ～3、5 ～6 對(duì)HL-60 細(xì)胞、化合物2～6 對(duì)K562 細(xì)胞的抑制作用與藥物質(zhì)量濃度有一定的依賴關(guān)系，以期為今后進(jìn)一步研究異葉敗醬的抗白血病作用提供參考。雖然單體化合物對(duì)白血病細(xì)胞表現(xiàn)出了體外毒性，但中藥成分復(fù)雜，異葉敗醬化學(xué)成分抗白血病作用的確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

表1 各化合物抗白血病細(xì)胞IC50值（μg／mL）Tab.1 IC50 values of various compounds on leukemia cells（μg／mL）