補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)慢性心力衰竭大鼠的保護(hù)作用

馮慶濤， 楊 靜， 張 燕， 呂尚增， 苗華為

（河北省中醫(yī)院，河北 石家莊050011）

慢性心衰是由多因素所致的病理過程［1］，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療過程中顯示出整體辨證和調(diào)節(jié)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)益強(qiáng)心片是由人參、黃芪、五加皮等組成的復(fù)方中藥制劑，臨床上用于治療冠心病、高血壓性心臟病所致慢性充血性心力衰竭［2-3］，并在《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識(shí)》 中推薦用于慢性心衰患者的治療。

PI3K-Akt 信號(hào)通路是與細(xì)胞生長、增殖密切相關(guān)的一條典型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活后可抑制細(xì)胞凋亡，改善心臟功能［4］。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備慢性心力衰竭大鼠模型，觀察補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)其作用，并初步探討該制劑對(duì)PI3K-Akt 信號(hào)通路及凋亡的影響，從而為其臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京） 2016-0011。實(shí)驗(yàn)期間大鼠于籠中飼養(yǎng)，每籠5 只，每天光照12 h，溫度20 ～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 試藥 補(bǔ)益強(qiáng)心片購自蘇州滋露藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字Z20050077）。大鼠N-端前腦鈉肽（BNP）、大鼠N-端前心鈉肽 （ANP） 酶聯(lián)免疫（ELISA） 試劑盒購自上海易利生物科技有限公司；B 細(xì)胞白血病／淋巴瘤抗原-2（Bcl-2）、白血病／淋巴瘤抗原相關(guān)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase-3）、磷脂酰肌醇-3 羥基激酶（PI3K） 及磷酸化（p-PI3K）、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt） 及磷酸化（p-Akt） 兔多克隆抗體均購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 POWERLAB-420E 生理記錄儀購自澳大利亞ADInstruments 公司；HX-300 動(dòng)物呼吸機(jī)購自成都泰盟科技有限公司；小動(dòng)物超聲儀超聲診斷系統(tǒng)購自意大利百勝集團(tuán)公司；Epics XL 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter 公司；SpectraMax M2酶標(biāo)儀購自美國分子儀器公司；ABI 300 熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 60 只大鼠隨機(jī)為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組及補(bǔ)益強(qiáng)心片低、中、高劑量組（0.18、0.36、0.72 g／kg）， 每組10 只。 手術(shù)后24 h開始給藥，補(bǔ)益強(qiáng)心組大鼠每天灌胃給藥，持續(xù)4 周，藥物分別用純水配制成0.018、0.036、0.072 g／mL 混懸液，而正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予等體積純水，各組給藥量均為1 mL／100 g。

2.2 模型建立［5］大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰臥位固定，連接生理記錄儀，經(jīng)口氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，打開胸腔，第2、3 肋骨之間鈍性分離胸膜，在左心耳下與肺動(dòng)脈根部約1.5 mm 處迅速穿線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，關(guān)閉胸腔后縫合，生理記錄儀可觀察到ST-T 弓背上抬，提示造模成功；假手術(shù)組大鼠只穿線而并不結(jié)扎；正常對(duì)照組大鼠不作任何處理。

2.3 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè) 給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，仰臥位固定，備皮，應(yīng)用超聲儀超聲診斷系統(tǒng)，二維超聲引導(dǎo)，根據(jù)心室波群的M 型曲線測(cè)量大鼠左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

2.4 BNP、ANP 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。大鼠頸動(dòng)脈取血，離心后取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書步驟操作， 酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值， 計(jì)算BNP、ANP 水平。

2.5 心肌細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取大鼠心臟左室壁心肌組織，剪碎后充分研磨，PBS緩沖液洗滌， 加入膜聯(lián)蛋白 V 和碘化丙啶（Annexin V-PI） 進(jìn)行聯(lián)合染色，混勻后置于冰浴中溫育，上機(jī)檢測(cè)凋亡率，流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長為488 nm。

2.6 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR 法。取大鼠心臟左室壁心肌組織，加入Trizol Reagent 冰浴勻漿，離心，提取總RNA，按試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入引物等反應(yīng)體 系， PCR 儀 擴(kuò) 增。 Bcl-2 正 向5′-GGATGACTTCTCTCGTCGCTAC-3′， 反 向5′-TGACATCTCCCTGTTGACGCT-3′，產(chǎn)物片段100 bp；Bax 正向5′-GGTTGCCCTCTTCTACTTTGC-3′， 反 向 5′-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3′， 產(chǎn) 物 片 段 239 bp；caspase-3 正向5′-GCGGTATTGAGACAGACAGTG-3′，反向5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′，產(chǎn)物片段95 bp； 內(nèi) 參GAPDH 正 向5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′， 反 向 5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，產(chǎn)物片段143 bp。采用RT-PCR 自帶的分析軟件，將正常對(duì)照組設(shè)定為1，以目的基因／GAPDH 相對(duì)定量值反映目的基因表達(dá)。

2.7 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取大鼠心臟左室壁心肌組織，加入預(yù)冷的組織裂解液充分勻漿，離心后取上清，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳變性，將分離蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移至膜，PVDF膜在脫脂奶粉溶液中孵育， 加入一抗或內(nèi)參GAPDH 進(jìn)行抗原抗體結(jié)合，再加入相應(yīng)二抗以結(jié)合一抗，采用化學(xué)發(fā)光法，X 膠片曝光顯影，分析軟件將掃描圖片進(jìn)行條帶灰度值數(shù)字化，以Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、 p-PI3K、 Akt、 p-Akt 灰度值／GAPDH 灰度值來校正誤差，所得比值反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 11.5 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，2 組間比較采用SNK-q 法，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 表1、圖1 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型組LVEDd、LVESd 顯著升高，LVEF 顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組LVESd 顯著降低，LVEF 顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），中、高劑量組LVEDd、LVESd 顯著降低，LVEF 顯著升高（P＜0.01）。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（，n＝10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups（，n＝10）

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（，n＝10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups（，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） LVEDd／mm LVESd／mm LVEF／%正常對(duì)照組 — 5.33±0.91 3.21±0.68 79.02±9.22假手術(shù)組 — 5.41±0.93 3.29±0.73 72.59±10.08模型組 — 7.89±1.14＃＃ 7.11±1.23＃＃ 35.16±7.39＃＃補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 6.79±1.18 5.91±0.97* 47.41±6.26**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 6.28±0.93** 5.86±0.81* 53.87±7.08**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 6.12±0.89** 5.15±0.77** 57.81±7.79**

3.2 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)BNP、ANP 水平的影響 表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組BNP、ANP 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)益強(qiáng)心片組兩者水平顯著降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠超聲心電圖Fig.1 Ultrasonic lectrocardiograms of rats in various groups

表2 各組BNP、ANP 水平比較（n＝10）Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups，n＝10）

表2 各組BNP、ANP 水平比較（n＝10）Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 （g劑·k量g-／1） （n B g·NLP-／1） （n A g·NLP-／1）正常對(duì)照組 — 125.86±23.27 35.89±6.01假手術(shù)組 — 127.05±19.35 38.54±6.30模型組 — 265.57±30.72＃＃ 69.05±9.52＃＃補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 182.72±20.27** 52.84±8.87**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 167.48±19.33** 49.27±8.59**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 165.81±19.22** 48.89±7.08**

3.3 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 表3、圖2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)益強(qiáng)心片組其凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較，n＝10）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn＝10）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較，n＝10）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn＝10）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 凋亡率／%正常對(duì)照組 — 5.23±1.11假手術(shù)組 — 6.01±1.08模型組 — 13.05±2.19＃＃補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 10.23±2.05**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 9.44±1.38**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 8.19±1.03**

3.4 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 表4～5、圖3 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)益強(qiáng)心片組Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高，Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較n＝5）Tab.4 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn＝5）

表4 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較n＝5）Tab.4 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn＝5）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） Bcl-2 Bax caspase-3正常對(duì)照組 — 0.96±0.16 1.03±0.14 0.89±0.09假手術(shù)組 — 1.02±0.17 1.09±0.21 0.93±0.11模型組 — 1.21±0.18＃＃ 2.89±0.23＃＃ 3.01±0.37＃＃補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 1.55±0.21* 1.92±0.19** 2.19±0.21**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 2.13±0.25** 1.69±0.17** 1.95±0.28**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 2.91±0.28** 1.51±0.15** 1.68±0.19**

圖2 各組大鼠細(xì)胞凋亡圖Fig.2 Cell apoptosis maps of rats in various groups

表5 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較（n＝5）Tab.5 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expressions among various groups（，n＝5）

表5 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較（n＝5）Tab.5 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expressions among various groups（，n＝5）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） Bcl-2 Bax caspase-3正常對(duì)照組 — 0.34±0.06 0.29±0.04 0.41±0.05假手術(shù)組 — 0.36±0.07 0.22±0.03 0.45±0.07模型組 — 0.48±0.07＃＃ 0.93±0.20＃＃ 1.09±0.15＃＃補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 0.54±0.09 0.71±0.15** 0.79±0.11**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 0.62±0.15* 0.66±0.12** 0.75±0.18**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 0.71±0.13** 0.42±0.05** 0.60±0.08**

圖3 各組大鼠心肌組織免疫印跡條帶圖Fig.3 Immunoblot band diagrams for rat myocardial tissues in various groups

3.5 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 的影響 表6、圖3 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)益強(qiáng)心片組兩者顯著升高 （P ＜0.01）。

表6 各組p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 水平比較 n＝5）Tab.6 Comparison of p-PI3K／PI3K and p-Akt／Akt levels among various groups，n＝5）

表6 各組p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 水平比較 n＝5）Tab.6 Comparison of p-PI3K／PI3K and p-Akt／Akt levels among various groups，n＝5）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 （g劑·k量g-／1） p-PI3K／PI3K p-AKT／AKT正常對(duì)照組 — 0.69±0.13 0.91±0.15假手術(shù)組 — 0.65±0.18 0.93±0.20模型組 — 0.21±0.04＃＃ 0.22±0.03＃＃補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 0.37±0.06** 0.42±0.05**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 0.54±0.09** 0.66±0.12**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 0.59±0.11** 0.71±0.15**

4 討論

導(dǎo)致慢性心力衰竭的病因很多，其中心肌梗死所致心力衰竭是重要促發(fā)因素，發(fā)生率高達(dá)32%～48%［6-7］。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備急性心肌梗死大鼠模型，4 周后測(cè)定其心功能參數(shù)，發(fā)現(xiàn)心室腔擴(kuò)大，心尖區(qū)或心前壁變薄，LVEDd、LVESd 明顯升高，左室射血分?jǐn)?shù)降低至45%以下，表明造模成功［8］。補(bǔ)益強(qiáng)心片由人參、黃芪、五加皮、丹參、麥冬、葶藶子組成［2］，其中人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫之功效［9］，黃芪具有益腎補(bǔ)血、泄虛補(bǔ)陽之功效，五加皮具有補(bǔ)中益精、堅(jiān)筋骨之功效，葶藶子具有行水化痰、理肝順氣之功效，給予該制劑后大鼠心室腔明顯縮小，LVEDd、LVESd 降低，射血分?jǐn)?shù)升高，表明它能改善慢性心衰大鼠心功能。

心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP） 是心臟分泌的重要多肽類激素，在正常生理狀態(tài)下機(jī)體少量分泌，而急性心肌梗死后心肌細(xì)胞會(huì)合成釋放大量該激素，故檢測(cè)兩者水平對(duì)心力衰竭診斷、治療、預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要［10］，與慢性心衰嚴(yán)重程度密切相關(guān)［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭大鼠血漿中ANP、BNP 水平高于正常組2 倍以上，；給予補(bǔ)益強(qiáng)心片后，它能在很大程度上降低兩者水平。

PI3K-Akt 信號(hào)通路是生命活動(dòng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子，也是許多效應(yīng)分子（如胰島素、生長因子等） 共用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與機(jī)體多種細(xì)胞生長、分化、凋亡等［12-13］，被認(rèn)為是一條重要的內(nèi)源性心肌肥大調(diào)節(jié)通路［14］，心肌梗死后缺血缺氧，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞異常增生，心臟正常結(jié)構(gòu)及功能極大受損；PI3K 被激活后，能使其下游信號(hào)分子Akt 磷酸化為p-Akt，轉(zhuǎn)膜至細(xì)胞核，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)生長、維持細(xì)胞生存等功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)益強(qiáng)心片能降低細(xì)胞凋亡率，抑制凋亡因子Bax、caspase-3 表達(dá)，升高Bcl-2 表達(dá)，p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 比值升高， 表明它可激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，抑制心衰后的心肌細(xì)胞凋亡及Bax、caspase-3 表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。