HPLC 法同時(shí)測(cè)定藿砂顆粒中7 種成分

潘艷琳， 程心玲， 肖 淋， 翁淑琴， 卓 實(shí)， 肖 欽

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州350004）

藿砂顆粒由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑藿砂口服液改進(jìn)劑型而來(lái)，是廣藿香、厚樸、澤瀉、茯苓等9 味中藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾化濕、和胃止瀉的功效，臨床上主要用于脾胃不和、脘腹脹痛、嘔吐瀉泄等病癥的治療。方中廣藿香味辛性微溫，化脾胃濕滯、避穢和中，砂仁味辛性溫，溫脾止瀉，化濕開胃，兩者合為君藥；厚樸、陳皮理氣燥濕，蒼術(shù)燥濕健脾，合為臣藥；茯苓、澤瀉淡滲利濕，神曲和胃消食，合為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥，對(duì)痞滿證、寒濕型腸易激綜合征等治療效果明顯［1-5］，但僅檢索到臣藥蒼術(shù)中茅術(shù)醇、β-桉葉醇含有量測(cè)定的報(bào)道［6-7］，未涉及君藥和其他成分。

中藥復(fù)方制劑發(fā)揮療效往往是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，僅測(cè)定單一藥味難以有效地控制其質(zhì)量均一性和療效一致性。為了全面控制和提高藿砂顆粒內(nèi)在質(zhì)量，參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定君藥藿香主要成分廣藿香酮，臣藥厚樸主要成分和厚樸酚、厚樸酚，佐藥澤瀉主要成分24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B，茯苓主要成分去氫土莫酸、茯苓酸的含有量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高完善提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；XS-205DU 型電子天平（萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。 和厚樸酚（110730-201614， 含 有 量 99.3%）、 厚 樸 酚（110729-201714，含有量100.0%）、23-乙酰澤瀉醇B（111846-201705，含有量99.7%） 對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；廣藿香酮（23800-56-8，含有量98%）、茯苓酸對(duì)照品（29070-92-6，含有量98.0%） 對(duì)照品購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司；24-乙酰澤瀉醇A（18674-16-3，含有量98.0%）、 去 氫 土 莫 酸 （6754-16-1， 含 有 量98.0%） 對(duì)照品購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。藿砂顆粒（每 袋 裝10 g， 批 號(hào)20180919、 20180928、20181009） 購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～13.0 min，52.0%A；13.0 ～18.0 min，52.0%→65.0%A；18.0 ～39.0 min， 65.0%→76.0%A； 39.0 ～47.0 min，76.0%→90.0%A； 47.0 ～55.0 min， 90.0%→52.0%A）；體積流量0.9 mL／min； 柱溫30 ℃；0～18.0 min 在310 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)廣藿香酮［8-9］，18.0～30.0 min 在294 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)和厚樸酚、厚樸酚［10-12］，30.0 ～55.0 min 在210 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸［10，13-14］；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸對(duì)照品適量，甲醇分別制成0.292、 0.948、 1.210、 0.172、 0.574、 0.238、0.306 mg／mL，精密吸取適量，甲醇制成含廣藿香酮14.6 μg／mL、和厚樸酚47.4 μg／mL、厚樸酚60.5 μg／mL、24-乙酰澤瀉醇A8.6 μg／mL、23-乙酰澤瀉醇B 28.7 μg／mL、去氫土莫酸11.9 μg／mL、茯苓酸15.3 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，研細(xì)，過(guò)80 目篩，精密稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲 醇50 mL， 密 塞， 稱 定 質(zhì) 量， 超 聲 提 取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方和生產(chǎn)工藝，分別制備缺廣藿香、厚樸、澤瀉、茯苓的陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)，均大于3 000；陰性樣品溶液相應(yīng)位置無(wú)其他色譜峰，表明陰性無(wú)干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于6 個(gè)20 mL 量瓶中，甲醇稀釋成25 倍梯度質(zhì)量濃度，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為1.03%、0.85%、0.68%、1.15%、0.94%、1.20%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒 （批號(hào)20180919），按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸含有 量 RSD 分 別 為 1.66%、 0.57%、 1.53%、0.88%、0.44%、1.91%、0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)20180919），室溫下放置0、2、4、8、16、24 h 后在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為0.99%、 0.83%、 0.71%、 1.47%、 0.82%、1.18%、1.05%，表明溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的顆粒（批號(hào)20180919） 適量，研細(xì)，過(guò)80 目篩，精密稱取6 份，每份0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（0.331 mg／mL 廣藿香酮1.0 mL、0.679 mg／mL 和厚樸酚2.0 mL、0.539 mg／mL 厚樸 酚3.0 mL、 0.194 mg／mL 24-乙 酰 澤 瀉 醇A 1.0 mL、0.681 mg／mL 23-乙酰澤瀉醇B 1.0 mL、0.253 mg／mL 去氫土莫酸1.0 mL、0.402 mg／mL茯苓酸1.0 mL），按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果， 廣藿香酮、 和厚樸酚、 厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸平均加樣回收率分別為97.61%、99.59%、100.03%、96.98%、98.57%、97.26%、98.29%，RSD 分 別 為 1.24%、 0.73%、 0.90%、 1.61%、1.36%、0.92%、1.03%。

2.4 樣品含有量測(cè)定 取3 批顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑（50%甲醇、甲醇［10-11，14］、50%乙醇、 乙醇［8-9，12］）、 提取方法 （超聲［10-11，13-15］、 回 流［9］）、 提 取 時(shí) 間 （15、 30、45 min） 對(duì)藿砂顆粒中廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸7 種成分含有量的影響，最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min，此時(shí)各成分提取完全，同時(shí)干擾少，重復(fù)性良好。

4 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定了藿砂顆粒中廣藿香酮、和厚樸酚、厚樸酚、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、去氫土莫酸、茯苓酸的含有量，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供有力的數(shù)據(jù)支持。