4種不同破紅液對血性胸水富集瘤細(xì)胞效果的研究

曾賽凡，王雪丹，陳余朋，張 聲，王行富

人體幾乎所有系統(tǒng)的惡性腫瘤都可能發(fā)生漿膜腔播散，以肺癌、胃腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多見，其中肺腺癌的轉(zhuǎn)移最常見[1]，多由腫瘤細(xì)胞破壞或瘤栓阻塞淋巴管、血管引起，因此常形成血性漿膜腔積液。通過漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢測往往可進(jìn)行早期診斷，積液沉渣細(xì)胞蠟塊制作是重要的補(bǔ)充診斷方法，但由于血性積液中含有大量紅細(xì)胞，可能掩蓋腫瘤細(xì)胞，對后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色和分子檢測均可造成困擾。因此，制片前溶解紅細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞更為集中，并保持完整的細(xì)胞形態(tài)和良好的抗原性尤為重要。本研究采用4種常見的低滲紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理，比較研究對蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-Eosin stain，H-E)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunocytochemical stain，ICC)的效果，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1樣本來源 收集2017年11月-2018年6月送檢并經(jīng)組織病理證實(shí)為肺腺癌的濃血性胸水樣本22例，男性15例，女性7例，年齡(48.50±4.50)歲(45～60歲)。

1.2方法

1.2.1分組 根據(jù)所用的破紅液的種類分為4組：A組采用1%乙酸液；B組采用50%乙醇液；C組采用50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液；D組采用1%乙酸+50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液，配制后備用。收到樣本后立即搖勻，取4管，各10 mL，分別加入4種破紅液，樣本與破紅液的比例是1∶4，在振蕩器中1 500 r/min充分混勻后，置于離心機(jī)中，2 500 r/min離心5 min，可見管底析出沉淀物，再加10%中性緩沖甲醛懸浮固定5 min，離心棄上清液，加75%乙醇混勻立即離心，棄上清液，加入95%乙醇室溫靜置2 h，凝集成塊后取出，用綿紙包裹，脫水包埋制成細(xì)胞蠟塊(cell block，CB)，4 μm切片，行H-E染色及ICC染色。

1.2.2ICC染色 采用ULtraVIEW兩步法檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，于全自動免疫組織化學(xué)染色儀(Roche BenchmarkXT，瑞士羅氏公司)中完成。檢測指標(biāo)：甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1，1∶200，8G7G3/1，鼠單抗，北京中杉公司，細(xì)胞核)、低分子量角蛋白(CK7，1∶300，OV-TL12/30，鼠單抗，福州邁新公司，細(xì)胞質(zhì))、上皮細(xì)胞表面糖蛋白(MOC-31，1∶100，鼠單抗，福州邁新公司，細(xì)胞膜)，陽性對照為肺腺癌組織切片。

1.3評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 由兩名副主任病理醫(yī)師閱片，評估H-E中紅細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤細(xì)胞分布和結(jié)構(gòu)及染色分值(表1)，ICC染色時陽性定位、強(qiáng)度及背景分值(表2)。每張染色片按得分評價(jià)：效果差為0～3分(白標(biāo))，效果一般為4～6分(灰標(biāo))，效果優(yōu)良為7～9分(藍(lán)標(biāo))，根據(jù)這3種分值制作標(biāo)記圖。

表1 細(xì)胞蠟塊H-E染色結(jié)果評價(jià)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位間距M50(P25～P75)描述，不服從參數(shù)檢驗(yàn)條件時采用秩和檢驗(yàn)比較4組破紅液作用效果的差異。所有P值為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。P<0.001為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 腫瘤細(xì)胞ICC染色結(jié)果評價(jià)

2 結(jié) 果

2.1H-E染色效果 4組破紅處理后，H-E染色鏡下均未見或僅有少量的紅細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞可見。但A組腫瘤細(xì)胞腫脹、核染色質(zhì)分散，結(jié)構(gòu)略模糊，染色過紅；B組腫瘤細(xì)胞量少，蛋白背景多，結(jié)構(gòu)清晰略有收縮，染色過紅；C組腫瘤細(xì)胞多分布均勻，輪廓清晰，形態(tài)完整、染色鮮艷；D組部分細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核固縮，染色不均勻(圖1)。C組在H-E染色中效果優(yōu)良藍(lán)色標(biāo)記最多，D組和B組次之，A組最差(圖2)。4組破紅液在H-E染色中的比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表3)。

2.2ICC染色效果 A組TTF-1只有2例弱陽性，20例未表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)彌散，背景明顯，細(xì)胞膜表達(dá)尚可；B組細(xì)胞量少呈現(xiàn)陽性或弱陽性表達(dá)；C組細(xì)胞呈均勻一致的棕褐色、陽性細(xì)胞數(shù)量多、無背景；D組腫瘤細(xì)胞表達(dá)不均勻，細(xì)胞核呈棕黃色、細(xì)胞質(zhì)和膜表達(dá)過強(qiáng)，背景明顯(圖1)。C組在抗原定位、陽性強(qiáng)度、背景干凈方面效果優(yōu)良藍(lán)色標(biāo)記最多，D組次之，A組和B組較差(圖2)。4組破紅液在TTF-1,CK7及MOC-31染色中的比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表3)。

表3 4組破紅液H-E及ICC染色效果秩和檢驗(yàn)結(jié)果對比

3 討 論

肺腺癌轉(zhuǎn)移至胸腔產(chǎn)生的血性胸水，因所含的紅細(xì)胞量的差異肉眼可呈現(xiàn)深淺不一的紅色，對于深紅色的濃血性胸水常因取材時血細(xì)胞過多、而有效腫瘤細(xì)胞較少或缺如，從而造成漏診或假陰性[2]。如何破壞紅細(xì)胞，使得樣本分層富集腫瘤細(xì)胞，是提高此類樣本的細(xì)胞病理檢出率的關(guān)鍵所在。血性樣本的破紅常常在細(xì)胞涂片上進(jìn)行處理，破紅后制作細(xì)胞蠟塊的文獻(xiàn)相對較少[3]。關(guān)于體液樣本分離紅細(xì)胞采用新型環(huán)保裂解劑、過濾裝置技術(shù)、Carnoy固定劑及生理鹽水水化技術(shù)(normal saline rehydration, NSRT)，均獲得一定的效果[4-6]，但操作技術(shù)要求及實(shí)驗(yàn)成本較高。本研究嘗試使用常見的破紅試劑，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)及組合運(yùn)用，尋找既能消除紅細(xì)胞又能讓腫瘤細(xì)胞形態(tài)相對保存完整的紅細(xì)胞溶解劑。

1%乙酸和50%乙醇作為低滲性的紅細(xì)胞溶解劑，溶血效果優(yōu)良。但在單獨(dú)使用時對腫瘤細(xì)胞的影響明顯，乙酸會引起腫瘤細(xì)胞的膨脹和細(xì)胞核的腫脹[7]，乙醇會大量地沉淀蛋白，使得腫瘤細(xì)胞分散，細(xì)胞輕度收縮。本實(shí)驗(yàn)嘗試了混合破紅液，D組中乙酸和乙醇同時分離紅細(xì)胞，破紅的速度最快，乙酸對腫瘤細(xì)胞的膨脹和乙醇的收縮作用可以部分抵消，但乙酸和甲醛作為固定劑時的穿透速度比乙醇快，所以部分被及時固定的有核細(xì)胞形態(tài)完整，蛋白保存尚可，而部分細(xì)胞腫脹細(xì)胞核收縮。C組中，甲醛液具有滲透能力強(qiáng)、固定均勻、組織收縮小的特點(diǎn)，加上50%乙醇可以消除紅細(xì)胞背景，沉淀蛋白形成支架，細(xì)胞聚集成塊，二者協(xié)同起到固定腫瘤細(xì)胞及溶解紅細(xì)胞的作用。而且10%中性緩沖甲醛可快速穿透固定腫瘤細(xì)胞，避免了乙醇對腫瘤細(xì)胞的收縮影響。甲醛與乙醇混合液的配制，二者間不同的混合比例、混合時長等均會造成其分子結(jié)構(gòu)的變化及對組織細(xì)胞蛋白質(zhì)效應(yīng)的差異[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50%的乙醇與10%中性緩沖甲醛混合效果良好。10%中性緩沖甲醛液對于保存細(xì)胞的形態(tài)和抗原方面更有優(yōu)勢，尤其是對細(xì)胞核的固定最佳[9]。本實(shí)驗(yàn)在抗體標(biāo)記的定位與強(qiáng)度方面與組織標(biāo)本有高度的一致性。

A1：H-E染色，腫瘤細(xì)胞腫脹、核染色質(zhì)分散，結(jié)構(gòu)略模糊，染色過紅；A2：TTF-1細(xì)胞核未表達(dá)；A3：CK7細(xì)胞質(zhì)表達(dá)彌散；A4：MOC-31細(xì)胞膜表達(dá)良好；B1：H-E染色，腫瘤細(xì)胞分布于蛋白背景中，細(xì)胞收縮，染色過紅；B2～B4：TTF-1，CK7及MOC-31腫瘤細(xì)胞少量陽性或弱陽性表達(dá)；C1：H-E染色，腫瘤細(xì)胞分布均勻，形態(tài)完整、染色鮮艷；C2～C4：TTF-1，CK7及MOC-31腫瘤細(xì)胞呈棕褐色均勻一致的表達(dá)；D1：H-E染色，腫瘤細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核固縮，染色不均勻；D2：TTF-1細(xì)胞核呈棕黃色表達(dá)；D3～D4：CK7及MOC-31腫瘤細(xì)胞表達(dá)過強(qiáng)，背景明顯.

圖2 22例樣本H-E及ICC染色分值標(biāo)記圖

深紅色血性胸水的送檢、取材、破紅、CB制作應(yīng)及時，以免造成蛋白大量沉淀、紅細(xì)胞包裹有核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞退變等。本次實(shí)驗(yàn)中，樣本21號和22號的分值低，破紅效果不良，可能是送檢不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞退變引起結(jié)構(gòu)破壞，ICC染色出現(xiàn)特異性著色或不著色，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

總之，針對深紅色血性胸水的樣本，不同的破紅液對制作細(xì)胞蠟塊H-E染色及ICC染色效果不盡相同，50%乙醇與10%中性緩沖甲醛混合液進(jìn)行破紅的效果最佳，可能具有推廣應(yīng)用的價(jià)值，但尚需進(jìn)一步更多樣本及多中心研究，同時，其針對分子病理的影響也需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。