大鼠梗阻性黃疸后不同時(shí)間行膽道引流對(duì)肝臟功能及組織病理的影響

劉元進(jìn)，沈?qū)幖?，張永?/p>

（海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院/東方肝膽外科醫(yī)院 膽道二科，上海 201805）

梗阻性黃疸可導(dǎo)致肝臟以及全身各系統(tǒng)的一系列病理生理改變，損傷肝臟功能，增加手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；膽道引流可以解除膽管的梗阻狀態(tài)，恢復(fù)肝臟功能。目前，已經(jīng)有大量的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)，對(duì)膽道梗阻后肝臟損傷的機(jī)制、生化指標(biāo)和肝組織病理變化的規(guī)律做了較為系統(tǒng)的研究，但是關(guān)于膽道引流后的變化，詳細(xì)的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠梗阻性黃疸及膽道引流模型，觀察其肝功能和組織病理的變化，以期為術(shù)前減黃在臨床的應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SD雄性大鼠，55只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（250±10）g；購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]。實(shí)驗(yàn)于上海睿太莫斯生物科技有限公司進(jìn)行[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2016-0004]；飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)光照周期（14 h白光，10 h黑夜），室內(nèi)溫度（20±2）℃、濕度40%～50%、標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：20180227-01），并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

生化儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)：Alpha-1506P，廠家：上海譜元儀器有限公司）；酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：DNM-9602，廠家：北京普朗新技術(shù)有限公司）；血凝分析儀（型號(hào)：CA52，廠家：Genrui）。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 膽道梗阻及引流模型的建立

大鼠在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，術(shù)前12 h禁食，6 h禁水。將動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上平臥固定，采用水合氯醛腹腔麻醉（7%，0.03 mL/g），麻醉后于腹部手術(shù)區(qū)域備皮，碘伏消毒，鋪無(wú)菌單，行正中切口進(jìn)腹，充分暴露后游離顯露膽總管。用絲線將膽總管十二指腸側(cè)結(jié)扎，切斷膽總管，將準(zhǔn)備好的細(xì)硅膠管一端插入膽總管肝臟方向，再用絲線雙重結(jié)扎固定，硅膠管另一端通過(guò)皮下隧道引至頸背部，用留置針夾閉器夾閉而后妥善固定于皮膚上，逐層關(guān)腹。需要進(jìn)行引流時(shí)，放開(kāi)硅膠管上的夾閉器即可形成膽汁外引流[1]。術(shù)畢待大鼠清醒后分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.4 分組

根據(jù)開(kāi)放引流的時(shí)間，將動(dòng)物隨機(jī)分為：梗阻3 d外引流組（A組）、梗阻7 d外引流組（B組）、梗阻14 d外引流組（C組）、梗阻21 d外引流組（D組）、梗阻28 d外引流組（E組）以及對(duì)照組。對(duì)照組在建模后直接放開(kāi)引流管，不進(jìn)行梗阻；A、B、C、D、E組分別于建模后的3、7、14、21、28 d開(kāi)放引流，所有組別的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至開(kāi)放引流后第35 d?？紤]到大鼠在梗阻性黃疸狀態(tài)下有一定的死亡率，故每組設(shè)有若干只備用大鼠，梗阻時(shí)間越長(zhǎng)的組備用動(dòng)物越多，其中A組7只，B組8只，C組10只，D組12只，E組14只，對(duì)照組4只，總計(jì)55只。

1.5 標(biāo)本的采集和處理

在同組中選取3只大鼠固定采集血液標(biāo)本（若其中有動(dòng)物死亡則以備用動(dòng)物代替），各組采集標(biāo)本時(shí)間為：開(kāi)放引流前，以及引流后第3、7、14、21、28、35 d。于尾靜脈取血2～3 mL，檢測(cè)總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、血清前白蛋白（PA）、凝血酶原時(shí)間（PT）。

其余大鼠用于采集肝臟組織標(biāo)本。各組采集肝組織標(biāo)本時(shí)間如下：A組在開(kāi)放引流前，以及引流后第3、7 d；B組在開(kāi)放引流前，以及引流后第3、7、14 d；C組在開(kāi)放引流前，以及引流后第3、7、14、21 d；D組在開(kāi)放引流前，以及引流后第3、7、14、21、28 d；E組在開(kāi)放引流前，以及引流后第3、7、14、21、28、35 d；對(duì)照組只采集血液標(biāo)本，不采集肝臟標(biāo)本。采集肝臟組織標(biāo)本采用再次開(kāi)腹的方式進(jìn)行，動(dòng)物麻醉后沿原切口進(jìn)腹，檢查無(wú)明顯膽汁滲漏，無(wú)腹腔內(nèi)出血、感染，而后用刀片切取小片肝臟組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片后常規(guī)脫蠟、脫水，HE染色，光鏡下行組織病理觀察；隨后將動(dòng)物處死，尸體焚燒掩埋。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，同時(shí)段各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察以及動(dòng)物存活情況

所有大鼠都在手術(shù)后1 h內(nèi)蘇醒并恢復(fù)正?；顒?dòng)。大鼠建模后1～3 d即可觀察到眼瞼、趾部、尾部出現(xiàn)黃染，尿色逐漸加深直至呈濃茶色；開(kāi)放引流后可見(jiàn)引流管引出黃色膽汁，頸背部毛皮可被膽汁沾染，但對(duì)動(dòng)物活動(dòng)未有明顯影響，動(dòng)物尿色及皮膚黃染逐漸減輕。在進(jìn)行肝組織標(biāo)本取材時(shí)，尚未開(kāi)放引流的動(dòng)物，開(kāi)腹后可見(jiàn)膽管肝門一側(cè)自絲線結(jié)扎處以上極度膨脹，管壁菲薄，其內(nèi)充滿膽汁，肝臟呈膽汁淤積表現(xiàn)；已經(jīng)開(kāi)放引流的動(dòng)物，開(kāi)腹后可見(jiàn)膽管無(wú)明顯膨脹，膽汁自硅膠管引流通暢，肝臟膽汁淤積較輕。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有12只大鼠意外死亡，其中A組1只，B組1只，C組3只，D組3只，E組4只。這些死亡的動(dòng)物多在死亡前1～2 d出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)下降、進(jìn)食進(jìn)水減少等現(xiàn)象。死亡動(dòng)物行簡(jiǎn)單尸檢，分析死亡原因有膽瘺、腹腔內(nèi)感染、肝腎功能衰竭、腸梗阻、腸粘連以及其他不明原因等。意外死亡的動(dòng)物自動(dòng)從實(shí)驗(yàn)中剔除。

2.2 肝功能改變

各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得大鼠TBIL、DBIL、ALT、ALP、PA、PT的值見(jiàn)表1～6。

TBIL在梗阻后第1周增幅為（78.08±3.36）μmol/L，第2周增幅為（29.0±7.63）μmol/L，第3周增幅為（15.74±6.91）μmol/L，第4周增幅為（12.64±1.37）μmol/L，在梗阻28 d后上升至（147.16±1.99）μmol/L。開(kāi)放引流后TBIL隨時(shí)間下降，A組在引流后7 d降至正常，B組在引流后14 d降至正常，而C組、D組和E組在實(shí)驗(yàn)周期中沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。

DBIL在梗阻后第1周增幅為（69.04±1.47）μmol/L，第2周增幅為（13.02±3.15）μmol/L，第3周增幅為（16.85±1.84）μmol/L，第4周增幅為（10.48±4.11）μmol/L，在梗阻28 d后上升至（116.94±1.33）μmol/L。開(kāi)放引流后DBIL隨時(shí)間下降，A、B兩組都在引流后7 d降至正常，C組、D組和E組在實(shí)驗(yàn)周期中沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。

表1 開(kāi)放引流后各時(shí)段TBIL的變化（μmol/L，±s）

表1 開(kāi)放引流后各時(shí)段TBIL的變化（μmol/L，±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比*P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比#P≥0.05

組別 0 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d A組 48.59±2.10 28.96±2.78 11.95±2.20* 11.18±1.91*# 10.05±1.03*# 9.70±1.94*# 10.00±1.83*#B組 89.77±3.31 42.49±2.64 23.32±1.24 12.75±1.27*# 11.65±0.93*# 10.76±0.64*# 11.23±0.60*#C組 118.77±4.43 79.53±5.25 74.02±2.72# 45.37±1.05 45.19±6.06 29.29±2.38 18.24±2.64 D組 134.51±2.64 119.31±1.24 111.47±4.07# 105.27±1.71 92.59±2.63 84.56±2.57 57.89±7.46 E組 147.16±1.98 129.79±4.63 114.52±3.86 113.32±2.18 110.04±2.43 105.73±2.05 93.58±4.16對(duì)照組 11.69±1.94 11.42±0.75 9.53±2.63 11.54±1.90 8.99±1.22 8.99±0.51 9.14±1.01

表2 開(kāi)放引流后各時(shí)段DBIL的變化（μmol/L，±s）

表2 開(kāi)放引流后各時(shí)段DBIL的變化（μmol/L，±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比*P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比#P≥0.05

組別 0 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d A組 43.76±2.62 20.47±1.15 6.83±1.27*# 6.16±0.79*# 6.25±0.91*# 7.27±0.96*# 6.49±1.04*#B組 76.59±2.62 28.75±4.85 11.75±3.48*# 10.12±2.06*# 9.72±0.37*# 9.43±0.73*# 9.47±0.49*#C組 89.60±5.39 60.42±3.51 48.76±2.40 42.41±4.19 30.12±3.67 23.52±4.03 14.46±1.19 D組 106.46±4.92 95.37±6.52 90.50±4.65 81.46±2.17 71.89±4.83 59.00±4.90 44.17±5.30 E組 116.94±1.33 110.41±4.73 107.01±6.39 102.33±3.65 100.85±4.98 87.21±5.54 87.60±2.39對(duì)照組 7.55±1.35 7.16±0.24 6.30±1.21 5.68±0.81 5.97±0.39 5.96±1.41 6.95±1.62

表3 開(kāi)放引流后各時(shí)段ALT的變化（U/L，±s）

表3 開(kāi)放引流后各時(shí)段ALT的變化（U/L，±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比*P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比#P≥0.05

組別 0 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d A組 155.33±2.51 127.34±7.96 97.39±5.90*# 96.95±3.82# 96.74±7.00# 82.59±4.75*# 72.00±8.39*#B組 248.35±5.74 168.02±6.45 114.52±7.73# 103.28±9.90# 95.00±12.48# 83.53±8.62*# 81.36±10.69*#C組 311.48±16.07 249.44±8.72 200.92±14.31 179.19±4.01 148.25±6.80 129.25±6.44 108.39±3.60 D組 338.03±9.45 281.41±6.39 247.30±24.01 228.63±5.83 251.69±9.54 185.04±5.17 147.91±3.54 E組 374.38±8.05 319.81±3.37 284.73±16.59 259.10±10.72 272.09±8.69 225.85±4.83 200.85±4.99對(duì)照組 87.53±8.18 72.99±12.57 78.01±10.89 65.95±7.03 70.02±5.58 72.63±6.08 72.71±7.03

表4 開(kāi)放引流后各時(shí)段ALP的變化（U/L，±s）

表4 開(kāi)放引流后各時(shí)段ALP的變化（U/L，±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比*P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比#P≥0.05

組別 0 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d A組 183.59±5.11 167.65±5.23# 144.41±4.02# 128.52±1.31 116.97±4.69 111.09±6.80* 94.61±6.99*B組 235.11±5.87 174.18±6.47# 151.13±10.78# 151.99±1.85 146.23±4.05 139.31±3.24 126.10±8.98 C組 274.81±6.74 223.93±6.84 204.79±5.76 196.56±8.60 184.87±5.12 165.40±4.62 147.26±5.73 D組 300.44±7.91 270.49±2.49 245.19±9.81 248.52±6.47 245.90±17.89 236.47±9.39 206.81±10.19 E組 326.07±13.70 304.88±5.73 279.55±8.52 281.56±7.34 272.75±8.15 280.22±9.41 267.27±5.57對(duì)照組 126.99±25.54 100.79±9.57 101.55±4.68 83.48±11.61 87.53±13.93 102.18±15.43 101.83±6.37

表5 開(kāi)放引流后各時(shí)段PA的變化（mg/L，±s）

表5 開(kāi)放引流后各時(shí)段PA的變化（mg/L，±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比*P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比#P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比△P≥0.05

組別 0 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d A組 154.99±1.75 172.03±3.84# 178.80±4.30*# 179.24±4.20*# 182.57±2.74*# 184.89±3.94*# 190.44±1.23*#B組 132.49±3.59 170.32±5.54# 171.06±1.16*# 178.57±1.08*# 183.69±1.58*# 184.32±7.72*# 184.68±5.60*#△C組 113.90±1.52 142.49±4.92 145.89±1.88 157.13±2.05 154.63±3.72 174.54±2.91* 180.12±2.37△D組 107.18±6.32 113.47±1.30△ 120.02±2.94 130.66±3.32 127.76±2.40 132.31±1.95 146.33±4.84 E組 98.45±2.81 105.83±2.04△ 104.41±2.95 107.76±3.97 108.50±5.75 108.92±3.17 112.76±5.03對(duì)照組 181.84±1.72 183.61±9.51 181.85±16.27 182.08±16.59 181.52±7.11 180.40±2.53 193.20±4.22

表6 開(kāi)放引流后各時(shí)段PT的變化（s，±s）

表6 開(kāi)放引流后各時(shí)段PT的變化（s，±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比*P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比#P≥0.05，同時(shí)間點(diǎn)兩組間相比△P≥0.05

組別 0 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d A組 10.35±0.98* 8.50±0.34*# 8.79±0.60*# 8.60±0.50*# 8.31±0.58*# 8.02±0.84*# 8.71±0.40*#B組 12.86±0.65* 9.60±0.56*# 9.29±0.44# 8.67±0.27*# 8.16±0.21*# 8.47±0.60*# 7.80±0.33*C組 14.70±0.37# 11.91±0.30△ 11.81±0.38○ 11.07±0.88 10.49±0.36 9.89±0.37 8.97±0.59#D組 14.64±0.79# 12.74±0.98△ 12.42±0.66○ 13.25±0.60△ 12.64±0.49△ 12.08±0.34 11.34±0.85 E組 16.52±0.50 15.91±1.20 14.36±0.19 13.90±0.34△ 13.26±0.61△ 13.48±0.31 12.78±0.39對(duì)照組 11.40±1.41 8.31±0.99 8.23±0.21 8.23±0.27 8.64±0.26 8.02±0.31 8.06±0.21

ALT在梗阻后第1周增幅為（160.82±2.65）U/L，第2周增幅為（63.13±21.80）U/L，第3周增幅為（26.55±25.40）U/L，第4周增幅為（36.35±17.03）U/L，在梗阻28 d后上升至（374.38±8.05）U/L。開(kāi)放引流后ALT隨時(shí)間下降，A、B兩組都在引流后28 d降至正常，C組、D組和E組在實(shí)驗(yàn)周期中沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。

ALP在梗阻后第1周增幅為（108.12±29.42）U/L，第2周增幅為（39.70±10.41）U/L，第3周增幅為（25.63±6.39）U/L，第4周增幅為（25.63±5.86）U/L，在梗阻28 d后上升至（326.07±13.70）U/L。開(kāi)放引流后，只有A組的ALP在引流28 d后恢復(fù)正常，其他各組都沒(méi)能恢復(fù)正常。

PA在梗阻后第1周降幅為（49.35±1.88）mg/L，第2周降幅為（18.59±5.03）mg/L，第3周降幅為（6.73±7.62）mg/L，第4周降幅為（8.73±6.62）mg/L，在梗阻28 d后降至（98.45±2.81）U/L。開(kāi)放引流后PA隨時(shí)間升高，A組和B組在引流后7 d恢復(fù)正常，C組在引流后28 d恢復(fù)正常，D組和E組在實(shí)驗(yàn)周期中沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。

PT在梗阻早期并無(wú)變化，A組和B組的PT與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，直到C組也就是梗阻14 d以后PT才逐漸延長(zhǎng)。開(kāi)放引流后PT逐漸恢復(fù)，但是恢復(fù)程度不明顯，C、D、E組在引流35 d后也沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。

2.3 肝臟組織病理學(xué)改變

各組在引流后肝臟的組織病理學(xué)改變?nèi)鐖D1～5。從圖中可以看出，在梗阻早期，肝細(xì)胞首先出現(xiàn)散在變性和壞死，并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；開(kāi)放引流后迅速恢復(fù)正常，僅殘余少量炎癥細(xì)胞（圖1）。梗阻7 d后，匯管區(qū)周圍炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，并出現(xiàn)小膽管樣上皮細(xì)胞增生；在開(kāi)放引流7 d后基本恢復(fù)到正常形態(tài)（圖2）。梗阻14 d后，小膽管樣上皮細(xì)胞增生顯著，并逐步向小葉中央深入，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)遭到破壞；開(kāi)放引流后，上皮細(xì)胞增生逐漸減輕，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常（圖3）。梗阻21 d后，可以看到成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生，假小葉形成；開(kāi)放引流后，肝組織損傷有所恢復(fù)但較為緩慢，至引流28 d，正常的小葉結(jié)構(gòu)仍沒(méi)有恢復(fù)（圖4）。梗阻28 d后，肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，膠原纖維廣泛增生，已經(jīng)呈現(xiàn)出肝纖維化樣表現(xiàn)；開(kāi)放引流后，肝組織的恢復(fù)極為緩慢，即使經(jīng)過(guò)35 d的引流仍然殘留有部分纖維化樣組織（圖5）。

3 討論

3.1 引流前后膽紅素的變化

膽道梗阻可造成膽管內(nèi)壓力持續(xù)升高，連接毛細(xì)膽管與細(xì)膽管的Hering壺腹發(fā)生機(jī)械性破裂，膽汁通過(guò)淋巴間隙滲入血竇而進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清膽紅素升高（以直接膽紅素升高為主），引起皮膚、鞏膜黃染等一系列癥狀[2]。有報(bào)導(dǎo)指出，大鼠膽管梗阻后很短時(shí)間內(nèi)就可以檢測(cè)到血清膽紅素升高，大約在7～14 d達(dá)到峰值，隨后維持在這一峰值或略有下降[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠TBIL和DBIL在膽管梗阻后的28 d內(nèi)持續(xù)升高，并沒(méi)有出現(xiàn)峰值和回落，只是在梗阻后期膽紅素上升速度較前期明顯放緩。膽管梗阻后，膽紅素在第1周的上升速度明顯快于1周以后，第1周的增幅比第2～4周增幅之和還要多，第4周的增幅僅為第1周的大約1/7。這表明膽道梗阻后膽紅素會(huì)在短期內(nèi)迅速上升，而后呈現(xiàn)出緩慢升高的趨勢(shì)。

圖1 A組大鼠肝臟組織病理變化（HE，×200）

圖2 B組大鼠肝臟組織病理變化（HE，×200）

圖3 C組大鼠肝臟組織病理變化（HE，×200）

圖4 D組大鼠肝臟組織病理變化（HE，×200）

圖5 E組大鼠肝臟組織病理變化（HE，×200）

膽道引流后，膽管內(nèi)壓力降低，毛細(xì)膽管與淋巴間隙之間的縫隙消失，膽汁不再逆流入血，血中膽紅素水平下降。本實(shí)驗(yàn)中，在開(kāi)放引流后TBIL和DBIL隨即開(kāi)始下降，引流后前3 d下降速度最快。梗阻7 d以上的其膽紅素下降速度明顯慢于梗阻7 d以下的。A組和B組的TBIL分別在引流后第7 d和第14 d降至正常，DBIL則都在引流后第7 d降至正常，但是后3組在實(shí)驗(yàn)中TBIL、DBIL都未能恢復(fù)正常。尤其是E組在引流35 d后其膽紅素水平僅下降了大約40%，并且仍處在一個(gè)較高的水平（比B組開(kāi)始引流前還要高），說(shuō)明其膽道引流的減黃效果很差。

臨床上梗阻性黃疸患者的膽紅素變化情況與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果很相似。大部分患者的膽紅素在出現(xiàn)黃疸癥狀后的1～2周內(nèi)會(huì)迅速上升，而后繼續(xù)緩慢升高，至于能達(dá)到的峰值是多少則因人而異。施行膽道引流后，不同患者膽紅素下降的速度有很大差異，部分患者的黃疸可以在1～2周內(nèi)基本消退，但是還有部分患者即使經(jīng)過(guò)數(shù)月的引流仍不能取得滿意效果，這正對(duì)應(yīng)了本實(shí)驗(yàn)中各組反應(yīng)出的情況。這說(shuō)明在排除了患者基本情況、原發(fā)疾病、引流操作技術(shù)等其他因素時(shí)，梗阻持續(xù)時(shí)間是影響膽道引流減黃效果的關(guān)鍵因素之一。

3.2 引流前后其他肝功能指標(biāo)的變化

膽道梗阻后肝臟的損傷是由多種因素共同作用造成的，其機(jī)制主要包括肝臟有效血流灌注減少，膽汁毒性，氧自由基機(jī)制，細(xì)胞因子機(jī)制，內(nèi)毒素機(jī)制，肝細(xì)胞凋亡機(jī)制，腸道菌群失調(diào)，營(yíng)養(yǎng)不良等[5-9]。ALT和ALP是臨床上用來(lái)反映肝細(xì)胞損傷的常用生化指標(biāo)。它們?cè)谀懝芄Ｗ韬笱杆偕仙?周的升高速度明顯快于1周以后。開(kāi)放引流后逐漸恢復(fù)，但是在A組和B組中可以看到ALT和ALP恢復(fù)正常的時(shí)間要晚于膽紅素。這提示肝細(xì)胞損傷的修復(fù)要晚于黃疸癥狀的消退。

膽道梗阻后肝臟合成蛋白質(zhì)功能受損，PA下降。本實(shí)驗(yàn)中膽道梗阻后，PA在第1周的降幅最大，在4周時(shí)間里總計(jì)下降了大約50%。開(kāi)放引流后PA逐漸升高，但是各組之間的差異很大。A組和B組在引流后7 d恢復(fù)正常，C組在引流后28 d恢復(fù)正常，但是D組和E組恢復(fù)得很慢，尤其是E組在引流后回升的幅度很小，甚至在引流3 d后就維持在一個(gè)較低水平?jīng)]有升高（其第3天與第35天相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P≥0.05）。這提示膽道梗阻時(shí)間很長(zhǎng)的患者，其肝臟蛋白合成功能可能嚴(yán)重受損，并且此時(shí)膽道引流對(duì)蛋白合成功能的改善效果也較差。

3.3 引流前后凝血功能的變化

梗阻性黃疸對(duì)凝血功能的影響是多方面的。一方面，由于腸道缺乏膽鹽而導(dǎo)致包括維生素K在內(nèi)的脂溶性維生素吸收困難，從而引起機(jī)體凝血功能障礙；另一方面，內(nèi)毒素血癥和全身性的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以刺激血管內(nèi)皮系統(tǒng)，啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致血栓形成和（或）彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）。梗阻性黃疸患者可同時(shí)存在凝血延遲、出血傾向、血液高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)等凝血異常[10]。凝血酶原時(shí)間（PT）是反映血漿中I、II、V、VII、X等凝血因子活性的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，PT在梗阻早期的變化不大，梗阻2周后PT值與梗阻前比較才開(kāi)始表現(xiàn)出差異，而且相比于其他指標(biāo)，PT的變化幅度較小。開(kāi)放引流后，膽道引流對(duì)凝血功能的改善效果也較差，C組、D組和E組的PT值在實(shí)驗(yàn)周期中都沒(méi)有恢復(fù)正常。這提示膽道梗阻（尤其在梗阻早期）對(duì)凝血功能的影響并不顯著，即使在梗阻時(shí)間較長(zhǎng)肝功能損傷已經(jīng)很嚴(yán)重的情況下，凝血功能異常仍在可接受的范圍內(nèi)；膽道引流（外引流）對(duì)凝血功能的影響也較小。

3.4 引流前后肝臟組織病理的變化

膽管梗阻后，肝臟組織的典型病理變化是小膽管增生與肝纖維化。肝細(xì)胞首先出現(xiàn)散在變性和壞死，并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)小膽管樣上皮細(xì)胞增生，毛細(xì)膽管擴(kuò)張，小葉中央?yún)^(qū)淤膽，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)遭到破壞，逐漸出現(xiàn)肝纖維化、假小葉形成，至梗阻后期可見(jiàn)肝硬化樣組織[11-12]。從本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果來(lái)看，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織的病理?yè)p傷逐漸加重，梗阻3～7 d主要以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主，梗阻14 d發(fā)展為大片壞死以及增生性改變，梗阻21 d出現(xiàn)輕度纖維化改變以及假小葉形成，梗阻28 d纖維化表現(xiàn)已經(jīng)較為明顯。開(kāi)放引流后病理?yè)p傷逐漸恢復(fù)，早期梗阻引起的輕度損傷恢復(fù)很快，而且基本可以完全恢復(fù)正常不留殘存病損；而晚期梗阻引起的重度損傷恢復(fù)得很慢，并且會(huì)殘留不能恢復(fù)的病損組織。當(dāng)肝組織出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和肝纖維化形成后，肝組織損傷就逐漸向不可逆階段發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠進(jìn)入這一階段的時(shí)間在膽管梗阻14 d以后。膽道引流的結(jié)果表明，大鼠膽道梗阻14 d以內(nèi)，膽道引流能夠取得較好的綜合療效，梗阻時(shí)間超過(guò)14 d，膽道引流的效果不理想。

3.5 臨床意義

目前，臨床上仍然多以膽紅素指標(biāo)來(lái)判斷梗阻性黃疸的嚴(yán)重程度，但是本實(shí)驗(yàn)表明，膽紅素在經(jīng)歷梗阻初期的快速升高后呈緩慢上升趨勢(shì)，此后雖然膽紅素不再有大幅度的變化但是肝臟損害仍然在持續(xù)加重，單一的膽紅素指標(biāo)已經(jīng)不能反映肝臟損害的嚴(yán)重程度。而患者出現(xiàn)黃疸癥狀的時(shí)間是提示肝損傷程度的重要信息。

關(guān)于梗阻性黃疸患者手術(shù)前的減黃治療，臨床上仍存在一定爭(zhēng)議，爭(zhēng)議焦點(diǎn)包括減黃治療的合理性，減黃的指征，減黃后手術(shù)時(shí)機(jī)，減黃的方式等[13-16]。本實(shí)驗(yàn)表明對(duì)梗阻時(shí)間較長(zhǎng)的患者，其肝功能損傷已經(jīng)比較嚴(yán)重，膽道引流的效果也比較差，如果進(jìn)行引流，可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到理想效果，并且即使做了減黃，其肝臟損傷也可能很難恢復(fù)到正常水平。對(duì)于此類患者應(yīng)當(dāng)結(jié)合其原發(fā)疾病，合理制定診療方案。若為良性疾病，宜予以充分的膽道引流并預(yù)留足夠長(zhǎng)的引流時(shí)間，待肝功能基本恢復(fù)后再行手術(shù)；若是惡性疾病或者因?yàn)榭陀^原因不能等待太長(zhǎng)時(shí)間，那么應(yīng)該客觀評(píng)估其手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，慎重實(shí)施合并大范圍肝切除的手術(shù)，此時(shí)選擇對(duì)肝臟損傷相對(duì)較小的術(shù)式可能更為理性。本實(shí)驗(yàn)還提示，膽紅素的恢復(fù)比肝功能和病理?yè)p傷的恢復(fù)要快，即使膽紅素已經(jīng)降至正常但是肝實(shí)質(zhì)損傷可能仍沒(méi)有完全恢復(fù)。若是患者基礎(chǔ)肝功能較差或擬施行對(duì)肝臟負(fù)荷較重的手術(shù)，最好能在膽紅素達(dá)標(biāo)后再繼續(xù)引流一段時(shí)間。

3.6 不足和展望

本研究存在著以下幾點(diǎn)不足：（1）實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，大鼠的體型較小，壽命較短，肝臟和膽道的解剖結(jié)構(gòu)與人類也有一定區(qū)別，大鼠的研究結(jié)果對(duì)人類不一定適用。（2）受實(shí)驗(yàn)條件和動(dòng)物生存情況的影響，本實(shí)驗(yàn)?zāi)懙拦Ｗ璧淖铋L(zhǎng)時(shí)間為28 d，膽道引流的最長(zhǎng)時(shí)間為35 d，如果梗阻和引流時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，肝臟會(huì)發(fā)生哪些變化尚不得而知。（3）本實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)只取了一份肝組織標(biāo)本，不能完全排除動(dòng)物個(gè)體差異的影響。（4）本實(shí)驗(yàn)僅觀察了光學(xué)顯微鏡下的組織病理變化，沒(méi)有更細(xì)微的超微結(jié)構(gòu)變化情況。（5）本實(shí)驗(yàn)僅研究了肝功能、組織病理等基礎(chǔ)改變，缺乏細(xì)胞因子、基因等深層次的機(jī)制研究。（6）本實(shí)驗(yàn)僅觀察了膽道外引流的情況，沒(méi)有膽道內(nèi)引流的情況。（7）本實(shí)驗(yàn)僅觀察了肝臟的變化，沒(méi)有研究其他臟器的變化。

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們對(duì)未來(lái)梗阻性黃疸和膽道引流的相關(guān)研究有如下展望：（1）增加樣本量，延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，比如膽道梗阻2個(gè)月后會(huì)有哪些變化？那些肝損傷較重的動(dòng)物如果繼續(xù)延長(zhǎng)引流時(shí)間，其損傷能不能恢復(fù)，多久能恢復(fù)？是否存在肝損傷完全不可逆的時(shí)間點(diǎn)？（2）加入膽道內(nèi)引流的實(shí)驗(yàn)，比較內(nèi)引流與外引流的差異。（3）加入電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)變化的觀察結(jié)果。（4）進(jìn)一步研究膽道梗阻和膽道引流后肝纖維化改變、肝細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞再生以及細(xì)胞因子變化的機(jī)制；進(jìn)一步研究膽道梗阻和膽道引流對(duì)腸道、腎臟、心血管系統(tǒng)等其他器官的影響；進(jìn)一步研究膽道梗阻和膽道引流對(duì)惡性腫瘤的影響。（5）以較大的動(dòng)物比如兔、狗、豬等為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較不同動(dòng)物之間的差異。（6）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行前瞻性臨床研究，提出可行的梗阻性黃疸和膽道引流的診療規(guī)范。