成品卷煙霉變微生物的分離純化與鑒定

雷 聲 楊乾栩 - 師艷萍 - 蔣舉興 - 劉秀明 -張 玲 陳文怡 - 汪雪嬌 - 曾熠程 -

(1. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

中國(guó)是世界第一煙葉生產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的1/3[1]。伴隨著中國(guó)卷煙消費(fèi)結(jié)構(gòu)的持續(xù)提升，消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)卷煙產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量的要求也日益提高。由于調(diào)制后的煙葉中含有豐富的糖、有機(jī)酸、生物堿等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為霉菌的生長(zhǎng)繁殖提供了條件。卷煙在流通及貯藏過程中，受環(huán)境溫度、濕度的影響，發(fā)生霉變現(xiàn)象有一定幾率，導(dǎo)致卷煙質(zhì)量瑕疵甚至報(bào)廢，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。

向東紅[2]從川渝不同地區(qū)的煙片中篩出了21種霉菌菌株，檢出率較高的主要為黃曲霉(Aspergillusflavus)和橘青霉(Penicilliumcitrinum)等；晏衛(wèi)紅等[3]從廣西的多處倉庫煙葉中分離鑒定出9種曲霉，包括黑曲霉(Aspergillusniger)和聚多曲霉(Aspergillussydowii)等；曾婷英等[4]對(duì)烘烤期的霉變煙葉進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致霉變的主要為米根霉(Rhizopusoryzae)。大多數(shù)研究都是對(duì)卷煙生產(chǎn)前倉儲(chǔ)期的霉變煙葉或煙片進(jìn)行篩選和鑒定，而成品卷煙在后續(xù)的流通及貯藏過程中霉變微生物的分離和鑒定研究較少，成品卷煙流通及貯藏期間所處環(huán)境(包括溫度、濕度等)與煙葉、煙片等在倉儲(chǔ)期間所處環(huán)境不同，對(duì)卷煙微生物的影響不同[5]。研究[6-8]表明，卷煙霉變微生物主要有曲霉屬、青霉屬和枝孢霉屬菌株。

試驗(yàn)擬采用3種不同的培養(yǎng)基涂布分離、劃線培養(yǎng)純化，再通過形態(tài)學(xué)和顯微鏡檢個(gè)體形態(tài)、18S rDNA-ITS序列測(cè)定，分離、純化和鑒定云南霉變卷煙中的微生物，并基于一種模擬卷煙環(huán)境的培養(yǎng)基，對(duì)篩分所得霉變微生物的致霉程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。旨在針對(duì)性地為銷售期及后續(xù)貯藏期的防霉措施及防霉包裝技術(shù)等提供科學(xué)依據(jù)，以減少卷煙經(jīng)濟(jì)損失，提高卷煙產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

霉變卷煙：以肉眼可見霉變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)，篩選出流通環(huán)節(jié)的霉變成品卷煙，分3批采樣，每批不少于100支，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心；

煙葉：云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心；

氯霉素、瓊脂、乳酸、氯化鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、甲基藍(lán)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、氯硝胺18%甘油瓊脂(DG18)培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；

煙汁培養(yǎng)基：5%煙葉浸出液1 000 g，氯霉素0.1 g，瓊脂18.0 g，115 ℃滅菌20 min。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：EL3002型，梅特勒—托利多有限公司；

生物安全柜：BSC-1500IIA2-X型，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：HWS-150型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-18SI型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；

金相顯微鏡：BX51型，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 卷煙霉變微生物的分離純化 參照GB 4789.15—2016的方法，稍作修改。稱取霉變成品卷煙10 g，加入0.85% 無菌生理鹽水90 mL，(28±1) ℃、180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)2～3 d，得到原始菌懸液，依次稀釋10倍梯度。吸取1 mL菌懸液涂布于孟加拉紅、PDA和DG18培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱(28±1) ℃、85% RH培養(yǎng)5 d。挑取少量菌落菌絲，劃線于相應(yīng)培養(yǎng)基中，(28±1) ℃、85% RH條件下培養(yǎng)2 d，純化3代，得到形態(tài)單一的菌落，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 卷煙霉變微生物的菌落特征分析 挑取1.2.1純化后的少量菌絲，點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基平板的中間位置，(28±1) ℃、85% RH條件下培養(yǎng)5 d。觀察菌落的形態(tài)特征，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[9]初步鑒定。

1.2.3 卷煙霉變微生物的個(gè)體形態(tài)特征分析 采用透明膠帶鏡檢法[10]。在載玻片上滴乳酸石炭酸棉蘭染液，用食指與拇指使透明膠帶呈U形，膠面朝下，輕輕觸及1.2.1 的單一菌落表面，浸入載玻片上的乳酸石炭酸棉蘭染色液中，顯微鏡下觀察，并根據(jù)GB 4789.16—2016進(jìn)行鑒定。

1.2.4 18S rDNA-ITS序列分析 參照Li等[11]方法，并稍作修改。取1.2.1得到的單一菌落平板進(jìn)行18S rDNA-ITS序列測(cè)定。18S rDNA-ITS區(qū)域PCR反應(yīng)使用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS片段，30 μL反應(yīng)體系含17.8 μL ddH2O，3 μL Buffer，2 μL dNTP，3 μL Primer1，3 μL Primer2，1 μL模板DNA，0.2 μL Tag酶。PCR反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，Marker條帶100，250，500，750，1 000，2 000，3 000，5 000 bp。北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行樣品的序列測(cè)定，所得序列拼接校準(zhǔn)對(duì)齊后，于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同源性>99%為種分界閾值，將待測(cè)菌株鑒定到種[12]。

1.2.5 卷煙霉變微生物致霉性測(cè)定 取50.0 g煙葉，加入1 000 mL蒸餾水煮沸，2層紗布過濾兩次后，加入18.0 g 瓊脂，定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，每200 mL培養(yǎng)基中加入20 mg氯霉素，搖晃均勻并冷卻備用，得到煙汁培養(yǎng)基平板。挑取1.2.1 純化后的少量菌絲，點(diǎn)植于煙汁培養(yǎng)基中心，倒置于(28±1) ℃、85% RH培養(yǎng)條件的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組3個(gè)平行。以未點(diǎn)植處理的煙汁培養(yǎng)基平板作為陰性對(duì)照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，通過Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 卷煙霉變微生物形態(tài)學(xué)分析

經(jīng)多次劃線分離、點(diǎn)植培養(yǎng)得到約20株形態(tài)不同的霉變菌株，對(duì)其培養(yǎng)形狀(如隆起度、邊緣、表面形狀、光澤、顏色等)進(jìn)行觀察；通過顯微鏡檢，觀察霉變微生物的分生孢子、分生孢子梗、頂囊、有無橫隔等個(gè)體形態(tài)情況，初步鑒定篩選得到形態(tài)各異的5個(gè)種，分別編號(hào)為A、B、C、D、E。霉變微生物菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)特征及其描述如圖1、2和表1所示。

由圖1可知，5種菌的菌落均呈圓形，C菌落近似橢圓形，A、C菌落表面光滑，B、D、E表面均呈絨毛狀；B、C、E菌落中心呈高凸起，其余為低凸起或無凸起；PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，B菌落直徑最大，除中間菌落外，培養(yǎng)基邊緣有孢子散落形成的較小菌落，生長(zhǎng)較為茂盛。

由圖2可見，5種菌株的菌絲均有隔膜，A、B、E菌株檢出有分生孢子梗，分別為掃帚狀、倒燒瓶狀和卵狀；C、D未檢出分生孢子梗，且菌絲有大量分支。

2.2 卷煙霉變微生物的菌株鑒定

由圖3可知，500 bp條帶濃度為60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為30 ng/3 μL。

圖1 霉變微生物菌落形態(tài)特征

圖2 霉變微生物個(gè)體形態(tài)特征

表1 霉變微生物菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)描述

電泳方向從上向下

將提取得到的DNA于高通量測(cè)序平臺(tái)上機(jī)檢測(cè)，得到18S rDNA-ITS序列，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性分析，找出與待測(cè)菌株序列相似度最高且已知分類地位的真菌菌株，根據(jù)待測(cè)菌株的形態(tài)學(xué)結(jié)果、鏡檢觀察結(jié)果和ITS序列分析鑒定待測(cè)菌株的種屬。5株卷煙霉變微生物鑒定結(jié)果為4個(gè)屬，分別為曲霉屬、青霉屬、枝孢屬和鏈格孢屬，相似度均在99%以上，所得5株卷煙霉變微生物鑒定結(jié)果如表2所示，分別為聚多曲霉、黃曲霉、極細(xì)枝孢霉、指狀青霉及鏈格孢屬菌(種名未知)，形態(tài)學(xué)及顯微鏡檢結(jié)果與18S rDNA-ITS序列測(cè)定結(jié)果相一致。

在卷煙霉變微生物分離和鑒定方面，李躍鋒等[6]篩選出卷煙致霉菌為球孢枝孢霉、黃曲霉、桔青霉和米曲霉；王儒等[7]篩選得到枝孢屬、桔青霉和黃曲霉等曲霉屬菌株；謝欣等[8]篩選得到枝孢霉屬、黃曲霉菌和桔青霉菌。試驗(yàn)篩選得到多個(gè)菌屬，與文獻(xiàn)[6-8]結(jié)果一致，曲霉屬、青霉屬和枝孢屬菌株常見于霉變卷煙，而試驗(yàn)篩選所得鏈格孢屬菌株未見報(bào)道，為首次發(fā)現(xiàn)。綜上可知，黃曲霉多次篩分自霉變卷煙，表明其在霉變卷煙中分布較為廣泛和突出；除黃曲霉外，試驗(yàn)篩選所得其他致霉菌種均與文獻(xiàn)[6-8]結(jié)果不同，可能與卷煙產(chǎn)地包裝環(huán)境和流通環(huán)節(jié)儲(chǔ)存環(huán)境等因素有關(guān)。

表2 卷煙霉變微生物的18S rDNA-ITS序列分析

將5株卷煙霉變微生物測(cè)試所得18S rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用鄰位相連法(Neighbor-Joining，NJ)進(jìn)行進(jìn)化距離分析[13]，運(yùn)用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次[14]。由圖4可知，5株卷煙霉變微生物的ITS序列聚為4個(gè)分支，劃分為曲霉屬、青霉屬、枝孢屬、鏈格孢屬，相同屬的進(jìn)化關(guān)系較近，以較高的支持率聚在同一分支。

圖4 卷煙霉變微生物的18S rDNA-ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹

Figure 4 Phylogenetic tree of the strains isolated frommoldycigarettes based on the 18S rDNA-ITS sequence

2.3 卷煙霉變微生物致霉性測(cè)試

由表3可知，在5種卷煙霉變微生物中，B黃曲霉致霉性最強(qiáng)，菌落直徑達(dá)(56.92±1.09) mm，為卷煙霉變微生物主要菌株，致霉能力突出，與李春艷等[15]從河南倉儲(chǔ)煙葉中分離、純化得到的優(yōu)勢(shì)霉變菌株相同；致霉性最弱的為極細(xì)枝孢霉，僅為(12.47±0.76) mm。

表3 卷煙霉變微生物致霉性測(cè)試

3 結(jié)論

研究采用PDA、DG18和孟加拉紅培養(yǎng)基，從霉變卷煙中分離純化出20株霉變微生物，再通過形態(tài)學(xué)和顯微鏡檢，初步鑒定為5種形態(tài)各異的霉變微生物，分別為2種曲霉屬菌，1種青霉屬菌，1種鏈格孢屬菌和1種枝孢屬菌。通過18S rDNA-ITS序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，鑒定為5個(gè)種，分別為聚多曲霉、黃曲霉、極細(xì)枝孢霉、指狀青霉和一株鏈格孢屬霉菌，與文獻(xiàn)[6-8]篩分所得菌屬基本一致，菌種有所不同，其中鏈格孢屬霉菌未見相關(guān)報(bào)道。通過致霉性試驗(yàn)進(jìn)一步明確黃曲霉菌[(56.92±1.09) mm]為卷煙霉變的主要菌株，同時(shí)也是卷煙霉變報(bào)道中多次出現(xiàn)的常見菌株和煙葉霉變優(yōu)勢(shì)菌株，具有導(dǎo)致煙葉及煙草制品霉變的廣泛性和突出性。霉變卷煙的微生物分布、致霉特征和優(yōu)勢(shì)菌株鑒定可為卷煙霉變防治、防霉劑研發(fā)等提供依據(jù)。