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    基于堿裂解法川貝母的鑒別

    2019-10-15 08:37:00陳玉秀彭必武李雨嫣
    食品與機械 2019年9期
    關(guān)鍵詞:川貝母貝母離心管

    陳玉秀 - 彭必武 - 李雨嫣 -

    (湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院,湖南 長沙 410208)

    川貝母是清咽潤喉類保健食品中常見的原料,為藥用植物川貝母的干燥鱗莖[1]。由于川貝母價格貴,市場零售價在4.8~6.8元/g,粉碎后易與其他同源植物,特別是浙貝母混淆。因此在《中國藥典》中,采用了分子生物學(xué)鑒定方法對川貝母進行鑒別,即通過聚合酶鏈?zhǔn)健拗菩詢?nèi)切酶多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術(shù),將川貝母正品特異性的DNA條帶與偽品進行區(qū)別。該方法具有特異性強、微量、準(zhǔn)確等特點[2],但該方法步驟復(fù)雜,操作費時。

    堿裂解法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性及復(fù)性的差異進行分離,利用高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性,同時沉淀蛋白質(zhì),再將pH值調(diào)至中性,由于質(zhì)粒DNA較小,容易復(fù)性成雙鏈,而染色體DNA較大,纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì),從而通過離心除去。這種方法具有操作簡單、提取速度快、價格低廉、通量大等優(yōu)點[3],現(xiàn)已廣泛用于小麥、玉米、花生、水稻[4]、番茄[5]、甜菜[6-7]等經(jīng)濟作物,在分子輔助育種、轉(zhuǎn)基因植物鑒定、SSR鑒定等方面起到重要作用,也可用于中藥材鑒定[8],在鑒定過程中,提取高質(zhì)量、高純度的基因組DNA是開展該方面研究工作的前提和關(guān)鍵過程[9]。但不同的生物樣本,堿裂解液不同。

    試驗擬通過對川貝母DNA提取所用堿裂解液進行篩選,旨在獲得一種快速鑒別川貝母的新方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    貝母:從產(chǎn)地、藥材市場及藥店購買25個樣品(見表1),所有樣品經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定,其中1號樣品為正品川貝母,所有樣品依次用75%乙醇、滅菌超純水清洗,吸干表面水分,置乳缽中研磨成極細(xì)粉;

    2-嗎啉乙磺酸(MES)、聚乙二醇4000(PEG4000)、曲拉通100(Triton X-100):北京索來寶科技有限公司;

    Low ladder(標(biāo)準(zhǔn)DNA分子):廣州東盛生物科技有限公司;

    交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVP):生工生物工程(上海)股份有限公司;

    表1 貝母樣品?

    ?※為對照樣本。

    rTaq酶(250 U)、SmaI酶(100 U)、10x聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液:日本TakaRa公司;

    核糖核酸酶(RNaseA):100 U,天根生物科技(北京)有限公司;

    脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP):江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司;

    引物5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3′和5′GCTACGTTCTTCATCGAT3′:湖南艾佳生物科技股份有限公司;

    乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、氯化銅等:分析純,北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    核酸定量儀:NanoDrop Lite型,美國Thermo公司;

    超低溫冰箱:Forma702型,美國Thermo公司;

    低溫臺式離心機:16K-R型,長沙鑫奧儀器儀表有限公司;

    醫(yī)用凈化工作臺:SE-CJ-2D型,蘇州凈化設(shè)備有限公司;

    熒光定量PCR儀:7300型,美國ABI 公司;

    PCR儀:THERM-1000型,美國Axygen公司;

    電泳儀:DYY-6C型,北京六一儀器廠;

    凝膠成像系統(tǒng):5000 Plus型,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 堿裂解法的篩選 堿裂解液的配置參照表2。取1號川貝母樣品10份各30 mg于1.5 mL離心管中,分別加入PA1~PA10提取緩沖液400 μL及RNaseA 0.5 μL,用漩渦振蕩器振蕩10~15 s,混勻,65 ℃水浴加熱5 min,取出。在PA1~PA5緩沖液管中分別加入0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 130 μL,在PA6~PA10緩沖液管中分別加入0.3 mol/L NaAc(pH 5.0)130 μL。分別經(jīng)漩渦混勻,冰浴冷卻3 min,14 000 r/min離心3 min;吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中,加入等體積(含6.0 mol/L氯化銅溶液,pH 5.5)25 mmol/L MES液,5 mmol/L MgCl2液及0.05% Triton X-100混合溶液,混勻,加到吸附柱上,10 000 r/min 離心1 min,棄過濾液,加入5 mol/L鹽酸胍、25 mmol/L MES、2 mmol/L氯化鎂溶液及0.05% Triton X-100混合溶液500 μL,10 000 r/min離心1 min,棄過濾液;再加入Tris-Base緩沖液500 μL,10 000 r/min離心1 min,棄過濾液;取出吸附柱,放入另一離心管中,加入50 μL洗脫緩沖液,室溫放置3 min,10 000 r/min離心1 min,將洗脫液再加入吸附柱中,室溫放置2 min,10 000 r/min 離心1 min,取洗脫液,在核酸定量儀上測定濃度與純度。

    表2 堿裂解液配方?

    ? N:0.5 mol/L氫氧化鈉;PVPP:1%聚乙烯聚吡咯烷酮40;NaCl:200 mmol/L氯化鈉液;MgCl2:5 mmol/L氯化鎂液;EDTA:2 mmol/L乙二胺四乙酸液;SDS:1%十二烷基硫酸鈉;PEG:40%聚乙烯二醇4000;Tr:1%曲拉通100;PVP:1%聚乙烯吡咯烷酮;Ac:醋酸鈉液;Tris:10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸液。

    1.3.2 PCR-RFLP反應(yīng)及電泳檢測

    (1) 鑒別引物:5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3′和5′GCTACGTTCTTCATCGAT3′。

    (2) PCR反應(yīng)體系:200 μL離心管中進行,反應(yīng)體系總體積30 μL,包括10×PCR緩沖液3 μL,二氯化鎂(25 mmol/L) 2.4 L, dNTP(10 mmol/L) 0.6 μL,上游引物(30 μmol/L) 0.5 μL,下游引物(30 μmol/L) 0.5 μL,高保真Taq DAN聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,模板1 μL,無菌超純水21.8 μL。

    (3) PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性4 min,循環(huán)反應(yīng)30次(95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s),72 ℃延伸5 min。取PCR反應(yīng)液,置500 μL離心管中,進行酶切反應(yīng),反應(yīng)體系總體積20 μL,包括10×酶切緩沖液2 μL,PCR反應(yīng)液6 μL,Sma I(10 U/μL)0.5 μL,無菌超純水11.5 μL,酶切反應(yīng)在30 ℃水浴2 h。另取無菌超純水,同上述PCR-RFLP反應(yīng)操作,進行空白對照。

    (4) 電泳檢測:參照瓊脂糖凝膠電泳法(中國藥典四部通則0541),膠濃度1.5%,膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與對照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為8 μL,DNA分子量標(biāo)記上樣量1 μL(0.5 μg/μL)。電泳結(jié)束后,取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 17.0軟件對OD260 nm/OD280 nm的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 堿裂解液的確定

    由圖1可知,通過10種不同的堿裂解液所提DNA經(jīng)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳,都能擴增出條帶,以PA5擴增出的條帶最成功、最清晰。10種堿裂解液中分別用到了SDS、PVP、PVPP、PEG、曲拉通100、EDTA、NaCl、Tris-HCl等試劑,在DNA提取中具有不同的作用。PA5裂解液中用到了PVP、EDTA、曲拉通100等,并用Tris-HCl為中和劑,PCR擴增后電泳圖結(jié)果較好,DNA濃度稍低,但OD值為1.84,接近純品DNA(如表3所示)。這可能與裂解液中PVP等有關(guān),有文獻[10]報道PEG、PVP可降低DNA濃度。但整體而言,以Tris-HCl為中和劑的裂解液比以醋酸鈉為中和劑的裂解液所得DNA濃度及純度好。因此選擇PA5堿裂解液作為川貝母DNA提取液,并對1號樣品進行PCR-RFLP反應(yīng)和電泳檢測,結(jié)果見圖2。

    1. Marker 2~11. 對應(yīng)表2中的PA1~PA10裂解液

    Figure 1 DNA electrophoresis maps of fritillaria cirrhosae bulbus extracted from 10 kinds of alkali lysis solutions

    M. Marker 1. 對照樣

    圖2顯示對照樣在100~250 bp有兩條清晰的DNA條帶,可見利用PA5堿裂解液進行川貝母DNA提取并進行PCR-RFLP反應(yīng)和電泳檢測,同樣可以滿足《中國藥典》利用分子生物學(xué)鑒別法對川貝母進行質(zhì)量檢測鑒別的目的。

    2.2 新方法驗證

    由表4可知,同一樣品,用藥典法和試驗方法在提取時間和成本上均有所不同。試驗方法比藥典法的提取時間要節(jié)省15~20 min,且單個樣品的檢驗成本顯著降低。

    2.3 試驗方法對不同川貝母樣品的檢測

    利用試驗方法對25個流通市場上所銷售的貝母進行DNA提取,PCR后進行酶切前的電泳檢測,對有電泳條帶的樣品進行RFLP檢測,結(jié)果如圖3~5。

    由圖3~5可知,1號作為對照樣在100~250 bp處有2條清晰條帶,且條帶均勻清晰,2、3、4、12、13、15、21、22、24號樣品與1號樣品一致,可鑒定為正品,而其他樣品與1號樣品不一致,且結(jié)合外觀性狀,可判定為川貝母偽品。

    表3 PA1~PA10堿裂解液提取DNA濃度與純度及電泳結(jié)果

    表4 兩種方法對比

    M. Marker 1~6. 對應(yīng)表1中相同序號的貝母樣品

    M. Marker 1、7~11. 對應(yīng)表1中相同序號的貝母樣品CK. 空白

    M. Marker 1、12~24. 對應(yīng)表1中相同序號的貝母樣品

    3 結(jié)論

    試驗研究了采用堿裂解法提取川貝母DNA的裂解液配比比例及方法,篩選獲得了200 mmol/L NaCl液,5 mmol/L MgCl2液,1% Triton X-100,1% PVP,2 mmol/L EDTA,1% SDS,0.1 mol/L Tris-HCl的裂解液可用于川貝母的DNA提取,此法不僅提取成本較《中國藥典》方法中規(guī)定的商品試劑盒費用顯著低,而且操作簡便、快捷,符合相關(guān)保健食品企業(yè)對川貝母快速鑒定的需求。由于貝母有多種入藥形式(完整藥材、破碎飲片、粉末),后續(xù)應(yīng)針對基因組提取的正確取樣方法進行研究,尤其是川貝母正品中摻混有少量偽品時。

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