處理方式對(duì)米根霉菌Rho18清除嘔吐毒素的影響

于小番 - 張 琛 許慧卿 - 丁香麗 - 袁亞明AN -

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000)

嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是一種真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)產(chǎn)生。DON具有多種毒性作用，包括急性毒性、慢性毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性等，歐盟將其定為三級(jí)致癌物[1]。由于中國(guó)的膳食結(jié)構(gòu)偏向于谷物，所以嘔吐毒素的危害就顯得更為突出。

現(xiàn)有糧食中DON清除方法主要有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法、生物脫毒法，但物理、化學(xué)脫毒方法均有不可避免的缺陷，如造成營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和適口性降低[2]。因此，生物脫毒法已逐漸成為研究清除糧食中DON毒素污染的重要方向，如Binder等[3]從牛瘤胃中得到一株可將DON毒素轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，He等[4]從雞腸道中分離出對(duì)DON毒素轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%的芽孢桿菌。目前生物脫毒的研究?jī)H集中于整菌株探索對(duì)霉菌毒素的降解作用，但究竟菌株是通過(guò)哪個(gè)部分、何種機(jī)制來(lái)達(dá)到清除DON的作用尚未見報(bào)道。

米根霉(Rhizopusoryzae)是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要發(fā)酵菌種之一[5]，是美國(guó)FDA認(rèn)證的安全菌株[6]。米根霉在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)酶種類豐富、活力高，能產(chǎn)生多種有機(jī)酸[7]。已有研究[8]證實(shí)根霉菌具有一定的霉菌毒素脫毒作用。試驗(yàn)擬以糧食發(fā)酵中常用的米根霉菌株Rho18作為研究對(duì)象，探討其菌懸液、發(fā)酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、細(xì)胞壁懸液對(duì)DON毒素的清除效果，以期為研究利用微生物清除糧食中DON毒素的實(shí)踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

米根霉菌Rho18：從傳統(tǒng)酒曲中選育，揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

嘔吐毒素(DON)：美國(guó)Sigma公司；

氯化鈉、甲醇：分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

DON ELISA檢測(cè)試劑盒：上海羽朵生物科技有限公司；

PDA培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；

電子天平：GL124-1SCN型，德國(guó)Sartorius公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1F型，蘇州凈化有限公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：X-22R型，德國(guó)Allegra公司；

超聲破細(xì)胞破碎儀：JY920- IID型，新芝生物科技股份有限公司；

酶標(biāo)分析儀：ZM-560型，中德伯爾生物技術(shù)有限公司；

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1200-6460 QQQ型，美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液及發(fā)酵上清液的制備 收集穩(wěn)定期(20～32 h)的Rho18發(fā)酵液，調(diào)節(jié)濃度至1012CFU/mL，隨后以100倍稀釋，獲得高、低2個(gè)濃度(1×1012，1×1010CFU/mL)的菌液。將各濃度發(fā)酵液于4 ℃以8 000 r/min 離心10 min，收集上清液和菌體。各濃度上清液分別用0.22 μm濾膜過(guò)濾后收集，濾液即為高、低2個(gè)濃度的Rho18發(fā)酵上清液。菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后，用生理鹽水重懸至原濃度，分別記為高、低2種濃度Rho18菌懸液，均于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 全菌裂解液及細(xì)胞壁懸浮液的制備 取1.3.1中高、低濃度Rho18菌懸液，用超聲波細(xì)胞破碎儀(輸出功率700 W，間隔時(shí)間5 s，每次裂解時(shí)間5 s，裂解總時(shí)間25 min，保護(hù)溫度0 ℃)對(duì)菌懸液進(jìn)行裂解(至鏡檢無(wú)完整細(xì)胞)。過(guò)濾，收集濾液，于4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取各濃度上清液，即為高、低濃度的Rho18全菌裂解液。對(duì)各組沉淀用生理鹽水洗滌3次并重懸至原溶液體積，即為高、低濃度的Rho18細(xì)胞壁懸浮液，均于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 粗提酶液的制備 取1.3.1中Rho18高、低濃度發(fā)酵上清液，于4 ℃以10 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾[9]收集各組濾液，即為高、低濃度的Rho18粗提酶液，均于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 小麥粉樣品制備 取市售小麥粉，滅菌，測(cè)定DON含量，適量添加標(biāo)品DON，調(diào)節(jié)DON含量大于特征值[(2 366±187) μg/kg[10]]，40 ℃干燥至恒重。

1.3.5 菌體成分對(duì)小麥粉中DON的清除試驗(yàn) 分別取Rho18各濃度菌懸液、發(fā)酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、細(xì)胞壁懸浮液，加入含有一定量DON的面粉樣品中，按1∶5 (g/mL)添加；以添加PBS作空白對(duì)照，于37 ℃，140 r/min的條件下孵育培養(yǎng)，分別在孵育5 h和10 h時(shí)取樣。

1.3.6 DON清除率的測(cè)定 樣品中DON的含量采用GB 5009.111—2016中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定，每組設(shè)置3個(gè)平行，取平均值按式(1)計(jì)算清除率。

(1)

式中：

CR——DON清除率，%；

a0——空白樣中DON含量，μg/10 g；

a1——處理樣中DON殘留量，μg/10 g。

1.3.7 DON降解產(chǎn)物的定性分析 對(duì)孵育10 h后高濃度處理組的DON降解產(chǎn)物，參照吳娛等[11]的方法，用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)進(jìn)行定性分析，其中模式為SEI，探頭溫度為250 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Rho18菌懸液對(duì)DON的清除效果

不同濃度的Rho18菌懸液對(duì)小麥粉樣品中DON的清除效果如表1所示。

表1 米根霉菌Rho18菌懸液對(duì)DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表1可知，低濃度Rho18菌懸液經(jīng)5 h孵育處理組對(duì)DON的清除率最低(1.28%)；高濃度菌懸液經(jīng)10 h孵育后對(duì)DON清除率為最高(37.13%)。孵育5，10 h時(shí)，高、低濃度Rho18菌懸液對(duì)DON的清除率存在顯著差異(P<0.05)；低濃度菌懸液組隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，盡管清除率有所提高，但無(wú)顯著差異。有研究[12]證實(shí)，米根霉、匍枝根霉等根霉屬微生物可以降解由鐮刀菌屬產(chǎn)生的毒素。試驗(yàn)表明米根霉Rho18菌株對(duì)小麥粉中的DON毒素有一定的清除作用，且清除作用在10 h內(nèi)與菌液的濃度、處理時(shí)間有明顯的正相關(guān)性，但具體的清除機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.2 不同濃度Rho18發(fā)酵上清液對(duì)DON的清除效果

不同濃度的Rho18發(fā)酵上清液對(duì)小麥粉樣品中DON的清除效果如表2所示。

由表2可知，小麥粉樣品與高、低濃度的米根霉菌Rho18發(fā)酵上清液孵育5 h后，高濃度組DON清除率為19.44%；經(jīng)過(guò)10 h孵育，高濃度組對(duì)DON的清除率(39.45%)顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明，Rho18發(fā)酵上清液對(duì)小麥粉樣品中的DON有清除作用，高濃度組延長(zhǎng)孵育時(shí)間可以顯著提高DON清除率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，孵育5，10 h后，低濃度處理組對(duì)DON的清除率顯著低于高濃度組，且低濃度組孵育5 h與10 h組間無(wú)顯著差異，可能與有效物質(zhì)濃度過(guò)低有關(guān)。米根霉菌發(fā)酵上清液中主要為菌株代謝產(chǎn)物，含有多糖、有機(jī)酸及小分子蛋白質(zhì)等多種有機(jī)物。其中部分有機(jī)酸具有還原型，可與DON毒素發(fā)生氧化還原反應(yīng)。Marleen等[13]研究表明還原劑可改變單端孢酶烯族毒素的分子結(jié)構(gòu)和生物活性。耿海榮等[14]篩選出的一株耐酸耐高溫的枯草芽孢桿菌，并證實(shí)其發(fā)酵上清液中含有可清除鐮刀菌產(chǎn)生的ZEN毒素，與試驗(yàn)結(jié)果相似。

表2 米根霉菌Rho18發(fā)酵上清液對(duì)DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

2.3 不同濃度Rho18全菌裂解液對(duì)DON的清除效果

不同濃度的Rho18裂解液對(duì)小麥粉樣品中DON的清除效果如表3所示。

表3 米根霉菌Rho18全菌裂解液對(duì)DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表3可知，小麥粉樣品與不同濃度的Rho18全菌裂解液經(jīng)過(guò)5 h孵育后，高濃度組DON的清除率(3.44%)顯著高于低濃度組(P<0.05)；經(jīng)過(guò)10 h孵育，高濃度組DON清除率顯著提高(P<0.05)，DON清除率呈現(xiàn)出隨濃度升高、孵育時(shí)間增長(zhǎng)而上升的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，Rho18細(xì)胞內(nèi)可能含有可清除DON的物質(zhì)，這種物質(zhì)對(duì)DON的清除作用與作用時(shí)間、全菌裂解液濃度有關(guān)。全菌裂解液中主要包括細(xì)胞器、胞內(nèi)酶和一些小分子物質(zhì)。推測(cè)微生物清除DON毒素的途徑：① 自身代謝酶作用[15]；② 多膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器對(duì)DON毒素存在吸附作用[16]。孵育10 h的效果顯著高于5 h，可能與酶的作用時(shí)間有關(guān)。具體何種酶具有良好的清除作用還需進(jìn)一步探究。

2.4 不同濃度Rho18粗提酶液對(duì)DON的清除效果

不同濃度的Rho18粗提酶液對(duì)小麥粉樣品中DON的清除效果如表4所示。

表4 米根霉菌Rho18粗提酶液對(duì)DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表4可知，小麥粉樣品與不同濃度組的Rho18粗提酶液孵育不同時(shí)間后，高濃度組的DON清除率均顯著高于相同孵育時(shí)間下的低濃度組(P<0.05)，高濃度組孵育10 h后對(duì)DON的清除率可達(dá)40.84%，低濃度組經(jīng)過(guò)不同孵育時(shí)間處理后無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，Rho18粗提酶液對(duì)小麥粉中的DON有清除作用，作用效果受酶的作用時(shí)間、濃度影響，在高濃度下，清除效果會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。粗提酶液的主要成分是Rho18穩(wěn)定期的胞外酶，包括淀粉酶、脂肪酶等，此階段酶活性較高。淀粉酶可將小麥淀粉水解為極限糊精，糊精對(duì)小分子物質(zhì)具有一定的包埋作用[17]，可固化DON毒素，從而降低DON毒素的檢出量；脂肪酶能夠催化水解環(huán)氧化合物，可以將DON轉(zhuǎn)化為DOM-1[15]，其毒性為DON的1/55[18]。多種酶類的綜合作用，間接或直接降低了小麥淀粉中DON毒素的含量。

2.5 不同濃度Rho18細(xì)胞壁對(duì)DON的清除效果

不同濃度的Rho18細(xì)胞壁懸液對(duì)小麥粉樣品中DON的清除率如表5所示。

由表5可知，小麥粉樣品與不同濃度組的Rho18細(xì)胞壁懸液混合作用，經(jīng)5 h孵育后，低濃度組(4.54%)顯著低于高濃度組(P<0.05)；處理10 h后，與處理5 h相比高濃度組對(duì)DON的清除率顯著提高(P<0.05)，低濃度組相較無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，Rho18的細(xì)胞壁對(duì)小麥粉中的DON毒素有一定的清除效果。

有研究[19]表明，微生物細(xì)胞壁對(duì)真菌毒素的清除作用可能包括物理吸附和生物降解。細(xì)胞壁的吸附作用主要是通過(guò)其中的肽聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等高分子物質(zhì)實(shí)現(xiàn)[16]。米根霉細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)和殼聚糖[20]，其中殼聚糖是米根霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多糖的主要成分，且大部分含1.28%左右的胺基，具有良好的吸附作用[21]。細(xì)胞壁的生物降解作用可能與細(xì)胞壁表面的酶類有關(guān)。米根霉菌細(xì)胞壁的殼聚糖對(duì)于酶具有良好的固化作用[22]，可同時(shí)吸附、固化某些酶。同時(shí)，細(xì)胞壁表面存在的一些具有類似于酶活性作用的表面蛋白，對(duì)DON也可能具有一定的降解作用。此外，米根霉菌細(xì)胞壁對(duì)金屬離子具有一定的吸附作用，Meng等[23]以米根霉細(xì)胞壁制備了同時(shí)可吸附Ni2+和Fe3+的雙吸收劑，張亞娟[24]發(fā)現(xiàn)黑根霉對(duì)Cd2+、Cr6+、Pb2+等重金屬有較高的吸附能力。金屬離子能夠與酶結(jié)合成金屬蛋白酶，對(duì)于酶的活性存在積極的影響[14]。因此，高濃度的Rho18細(xì)胞壁具有較高的DON清除能力可能與這些金屬離子能夠輔助米根霉菌細(xì)胞壁清除DON有關(guān)。

表5 米根霉菌Rho18細(xì)胞壁對(duì)DON的清除率?

? 小寫字母不同表示同列間的差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示同行間的差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

由表1～5可以看出，經(jīng)過(guò)同一處理方式處理的米根霉Rho18與小麥粉樣品混合，其清除率與時(shí)間呈正比關(guān)系。不同方式處理的Rho18對(duì)小麥粉中DON的清除效果存在差異，其中細(xì)胞壁對(duì)DON的清除效果最好，其次是發(fā)酵上清液。米根霉菌Rho18所產(chǎn)的酶大部分為初級(jí)代謝產(chǎn)物，且細(xì)胞內(nèi)外均存在[25]。試驗(yàn)所制備的Rho18全菌裂解液、粗提酶液中均含有一定比例的酶或小分子代謝物質(zhì)，但因各成分液所含酶系及有機(jī)物質(zhì)種類存在差異，而導(dǎo)致不同處理的Rho18對(duì)DON的清除率存在差異。細(xì)胞壁對(duì)DON毒素除由于結(jié)構(gòu)特性而存在吸附作用外，其固化的酶對(duì)于DON毒素也可能存在清除作用，因而細(xì)胞壁對(duì)DON毒素的清除效果較好。

2.6 DON降解產(chǎn)物的定性分析

高濃度的Rho18用不同處理方式后，與小麥粉共同孵育10 h，用LC-MS測(cè)定DON的降解產(chǎn)物，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 高濃度Rho18不同處理方式孵育10 h后降解產(chǎn)物的LC-MS圖譜

由圖1可知，DON標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量為293.30，經(jīng)過(guò)Rho18菌懸液、發(fā)酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液以及細(xì)胞壁懸液處理10 h后，均產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量為277，281左右的兩種新物質(zhì)，其中DON經(jīng)Rho18懸液處理后可產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量為279，281左右的兩種物質(zhì)。以上結(jié)果表明，不同處理方式的Rho18可通過(guò)生物降解DON產(chǎn)生新的物質(zhì)。

相關(guān)研究[16,26]顯示，DON在糖苷酶作用下可進(jìn)行3C-糖苷化，生成低毒性的降解產(chǎn)物；同時(shí)，DON作為烯醇類化合物，含有環(huán)氧基團(tuán)和羥基，環(huán)氧化合物在脂肪酶作用下可被水解。樂(lè)華愛等[27]研究證實(shí)根霉菌可產(chǎn)生高活性的糖苷酶，可降解DON。此外，根霉菌可產(chǎn)生脂肪酶[28]、酸性蛋白酶以及酒化酶系[29]，但這些酶系是否具有開C12/C13環(huán)氧基，或是在復(fù)雜酶系作用下與有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，進(jìn)一步氧化或分解DON，還需進(jìn)一步論證。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，米根霉菌Rho18對(duì)DON的清除率因處理方式、濃度及孵育時(shí)間而不同，其中高濃度的Rho18細(xì)胞壁懸液與小麥粉孵育10 h后，小麥粉中嘔吐毒素的清除率最高(51.62%)，其作用機(jī)制可能與Rho18細(xì)胞壁對(duì)DON生物降解和物理吸附作用有關(guān)。LC-MS測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)不同方式處理的米根霉Rho18與DON作用后均有新物質(zhì)生成，可能與根霉菌豐富且高活性的酶系有關(guān)，但具體由何種酶系發(fā)揮主要作用，仍需進(jìn)一步研究。