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    Marc-145細(xì)胞微載體?;囵B(yǎng)PRRSV

    2019-10-15 01:56:02劉鑫瑩
    飼料博覽 2019年9期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)滴度復(fù)數(shù)

    趙 剛,閆 冰,劉鑫瑩

    (哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,哈爾濱 150000)

    豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)主要侵害繁殖母豬和仔豬,引起母豬繁殖障礙、仔豬的呼吸道疾病和較高的死亡率。PRRS 的暴發(fā)蔓延,給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,在中國每年有200 萬頭豬感染,近40 萬頭豬死亡。目前尚無針對該病的有效治療藥物,開發(fā)高效、安全、廉價的病毒疫苗是預(yù)防、控制PRRSV 感染的唯一可行辦法。目前國內(nèi)Marc-145 細(xì)胞制備豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒均采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝,由于受到轉(zhuǎn)瓶表面積和培養(yǎng)條件的限制,生產(chǎn)細(xì)胞密度低,勞動強(qiáng)度大,操作過程易污染,疫苗質(zhì)量難以得到保證。本研究采用細(xì)胞生物反應(yīng)器技術(shù)生產(chǎn)PRRSV 抗原,并對培養(yǎng)過程中的各項技術(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化,從而總結(jié)出一套較為合理的生產(chǎn)工藝,為PRRSV的大規(guī)模培養(yǎng)提供可靠的參考數(shù)據(jù)。

    1 試驗材料

    1.1 細(xì)胞及病毒

    Marc-145 細(xì)胞(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),PRRSV HuN4-F112株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。

    1.2 主要試劑

    MEM 培養(yǎng)基(購自GIBCO 公司);新生牛血清(購自濟(jì)南勁牛生物科技有限公司);微載體Cytodex-1(購自德國GE 公司);胰蛋白酶(購自美國Sigma 公司);結(jié)晶紫細(xì)胞裂解液(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制)。

    2 試驗方法

    2.1 Marc-145細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

    將細(xì)胞凍存管自液氮罐中取出,置于37 ℃水浴,使管內(nèi)凍存液迅速融化。常溫1 000 r·min-1離心5 min。棄去上清,用少量細(xì)胞生長液將細(xì)胞重懸后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入10 mL 細(xì)胞生長液,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層后,用胰酶-EDTA 消化液消化,并按1:3進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

    2.2 PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增值

    Marc-145 細(xì)胞是PRRSV 的敏感細(xì)胞,病毒液不用激活。取已長成致密單層的細(xì)胞,棄掉其中的生長液,用不含血清的DMEM 洗細(xì)胞面3 次。吸凈殘余的維持液,加入PRRSV 病毒液0.2 mL,37 ℃吸附60 min,其間搖晃1 次·20 min-1,使病毒均勻、充分地吸附到細(xì)胞上。加入10 mL 的維持液,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞病變,當(dāng)80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲病毒。將收獲的病毒液于-20~37 ℃反復(fù)凍融3 次,保存于-80℃冰箱。

    2.3 微載體預(yù)處理

    稱取所需質(zhì)量的微載體Cytodex-1,按100 mL:1 g 的比例用PBS 浸泡微載體,輕微攪拌使微載體均勻浸泡3 h,121 ℃、滅菌30 min;倒掉PBS,以30 mL:1 g 的比例用培養(yǎng)基將微載體洗滌2 次,將微載體放置在4 ℃冰箱內(nèi)平衡過夜,待用。

    2.4 微載體細(xì)胞計數(shù)

    取1 mL 含微載體的培養(yǎng)液,900 r·min-1離心5 min,后棄掉上清液,加入與上清液相同體積的0.1%結(jié)晶紫溶液,混勻后于37 ℃中孵育1 h,然后用血球計數(shù)板計數(shù)釋放出來的細(xì)胞核,即為1 mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)。

    2.5 病毒含量測定

    將病毒液作連續(xù)10倍稀釋,取1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-85 個稀釋度,分別接種已長成良好單層Marc-145 細(xì)胞、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔細(xì)胞板中,每個稀釋度接種6 孔,100 μL·孔-1,同時設(shè)正常細(xì)胞對照,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,逐日觀察細(xì)胞病變情況,并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù),按Reed-Muench法計算TCID50。

    2.6 微載體培養(yǎng)PRRSV試驗條件的優(yōu)化

    2.6.1 病毒維持液中血清濃度的確定

    以4.0×105cells·mL-1的密度接種Marc-145 細(xì)胞,微載體Cytodex-1 的用量為4 g·L-1,待細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,停止攪拌,靜置使微載體沉淀,吸出上清液,用DMEM 洗滌3 次,按感染復(fù)數(shù)為0.1 的量加入PRRSV 病毒液,然后分別加入血清濃度為1%、2%、3%的病毒維持液,于不同時間取樣測定病毒含量。確定病毒維持液中血清濃度。

    2.6.2 病毒接毒時間的確定

    以4×105cells·mL-1的密度接種細(xì)胞,微載體Cytodex-1 的用量為4 g·L-1,分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48 和72 h 后,停止攪拌,靜置使微載體沉淀,吸出上清液,用DMEM 洗滌3 次,按感染復(fù)數(shù)為0.1的量加入PRRSV 病毒液,最后加入血清濃度為2%的病毒維持液,于不同時間取樣測定病毒含量。確定最適的接毒時間。

    2.6.3 感染復(fù)數(shù)(MOI)及最佳收獲時間的確定

    以4×105cells·mL-1的密度接種細(xì)胞,微載體Cytodex-1 的用量為4 g·L-1,細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后,停止攪拌,靜置后吸出上清液,用DMEM 洗滌3 次,分別按感染復(fù)數(shù)為0.20、0.05 和0.01 的量加入PRRSV,最后加入血清含量為2%的病毒維持液,于不同時間取樣測定病毒含量。確定感染復(fù)數(shù)及最適收毒時間。

    2.7 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Marc145細(xì)胞增殖PRRSV

    將Marc145 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),增殖至10 L 轉(zhuǎn)瓶中,培養(yǎng)72 h 后,細(xì)胞匯合度>90%,按每個轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞數(shù)為2.6×108個·mL-1、MOI 為0.05 進(jìn)行PRRSV接種培養(yǎng)。病毒接種后48 h收獲,并進(jìn)行病毒含量的測定。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增殖

    PRRSV感染Marc-145細(xì)胞見圖1。

    由圖1 可知,正常的Marc-145 細(xì)胞于傳代后3 d 即可長成致密單層,透光性好、立體感強(qiáng)、界限清晰;接種PRRSV 后12 h,出現(xiàn)細(xì)胞病變,細(xì)胞界限模糊、透光性變差、細(xì)胞融合拉網(wǎng)、圓縮脫落。

    圖1 PRRSV感染Marc-145細(xì)胞

    圖2 維持液中血清濃度對病毒增殖的影響

    3.2 病毒維持液中血清濃度的確定

    當(dāng)病毒維持液中血清濃度分別為1%、2%、3%時,于不同時間取樣測定病毒含量結(jié)果見圖2。

    由圖2 可知,用血清濃度為1%的病毒維持液培養(yǎng)時病毒滴度較低;維持液血清濃度為2%、3%,對病毒滴度影響不明顯,病毒滴度均較高。綜合考慮本試驗維持液中血清濃度采用2%。

    3.3 接毒時間的確定

    分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后接毒,于不同時間取樣測定病毒含量結(jié)果見圖3。

    圖3 感染時間對病毒增殖的影響

    由圖3 可知,在細(xì)胞培養(yǎng)24 h 時細(xì)胞貼球率為40%,病毒滴度最低;在細(xì)胞生長最高峰72 h 時,細(xì)胞貼球率>90%,接毒后病毒滴度最高為106.2TCID50·mL-1。由此可見PRRSV 增殖的效果與接毒時的細(xì)胞生長情況有關(guān),接毒時細(xì)胞數(shù)量愈大,病毒滴度愈高,反之則較低。

    3.4 感染復(fù)數(shù)(MOI)和收毒時間的確定

    不同感染復(fù)數(shù)對PRRSV 增殖的影響結(jié)果見圖4。

    圖4 感染復(fù)數(shù)對病毒增殖的影響

    由圖4 可知,過高或過低的感染復(fù)數(shù)(0.50 和0.01)均導(dǎo)致較低的病毒滴度,說明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復(fù)數(shù)為0.05 時可獲得最高的PRRSV 增殖效價,達(dá)到106.4TCID50·mL-1。此外各組試驗結(jié)果均顯示,接毒后48 h 的病毒效價均高于接毒后72 h的病毒效價,說明接毒后48 h可以作為收獲病毒的最適時間。

    3.5 不同培養(yǎng)系統(tǒng)中病毒含量的比較

    試驗結(jié)果可知,反應(yīng)器生產(chǎn)病毒含量為106.6TCID50·mL-1、轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)病毒含量為106.3TCID50·mL-1。表明用反應(yīng)器生產(chǎn)病毒毒價比轉(zhuǎn)瓶高。

    4 討論

    病毒維持液中血清濃度的比較試驗表明,使用維持液中血清含量1%不利于細(xì)胞的生長和繁殖,因此收獲的病毒滴度也較低;血清含量2%、3%的對細(xì)胞生長最為有利,獲得的毒價較高,但毒價差別不大。血清濃度也不能過高,血清濃度過高血清掩蔽了病毒與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致病毒與細(xì)胞結(jié)合受阻,從而影響病毒的增殖。本試驗選擇最適的血清濃度為2%,因為此濃度下即保證細(xì)胞生長繁殖所需的營養(yǎng),利于病毒毒價的提高,又可降低成本。

    接毒時間過早,細(xì)胞處于生長早期,細(xì)胞數(shù)量較少,產(chǎn)生的病毒滴度也較少;如果接毒過晚,微載體上細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞處于衰老階段,同樣影響病毒的增殖。在細(xì)胞生長到72 h時細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大,接毒時產(chǎn)生的病毒含量最高。由此可見PRRSV增殖的效果與接毒時的細(xì)胞生長情況有關(guān),接毒時細(xì)胞數(shù)量愈大,病毒滴度愈高,反之則較低。

    感染復(fù)數(shù)(MOI)即單個細(xì)胞感染病毒的顆粒數(shù),由此可確定接種病毒的劑量。MOI值可通過測定病毒感染性滴度和接種細(xì)胞的個數(shù)獲得。本研究以不同MOI 感染Marc-145 細(xì)胞,分析其對病毒滴度的影響。本研究中0.05 的感染復(fù)數(shù)最為匹配PRRSV 感染及增殖過程的要求,試驗結(jié)果表明,過高或過低的接毒量均不利于PRRSV 的增殖,其具體內(nèi)在機(jī)理可能與Marc-145 細(xì)胞上PRRSV 的受體蛋白質(zhì)表達(dá)豐度存在顯著相關(guān),有待深入研究。

    試驗研究了反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶不同培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)PRRSV。結(jié)果表明,用轉(zhuǎn)瓶與反應(yīng)器生產(chǎn)病毒毒價相近,病毒含量分別為106.7和106.3TCID50·mL-1。由于本文所研究的工藝是要適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),因此必須從操作的便利、成本以及最終效果來確定。

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