磷酸鈣材料在骨再生中的應(yīng)用進(jìn)展

劉兆強，朱立國

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 骨科，陜西 咸陽 712046

引言

骨再生由一系列協(xié)調(diào)的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的生物過程所組成，環(huán)境條件和底物之間的相互作用形成破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的平衡[1]。骨再生在臨床領(lǐng)域進(jìn)行了大量的體外和體內(nèi)研究，涉及許多生物學(xué)過程，如破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的相互作用，成骨分化，骨的刺激作用，細(xì)胞生長，信號通路和骨生長因子等生物過程[2]。生物材料在體內(nèi)應(yīng)具有生物穩(wěn)定性和生物相容性，并且不會引起免疫反應(yīng)。我們臨床上常用的材料包括聚合物、金屬和碳基陶瓷，但是這些材料出現(xiàn)機械性能差、生物相容性低、與人體組織粘附性差等缺點[3]。我們?yōu)榱丝朔@些問題，利用天然人骨中豐富的磷酸鈣基陶瓷作為生物材料。據(jù)報道，磷酸鈣具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性，它們有助于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，因此，許多人對磷酸鈣用于骨再生進(jìn)行了研究[4]。我們將通過研究磷酸鈣的生物活性和骨再生應(yīng)用來總結(jié)使用磷酸鈣的骨再生策略。

1 磷酸鈣的生物活性

磷酸鈣是由鈣陽離子和磷酸鹽陰離子組成的礦物質(zhì)，人體中60%無機材料都含有磷酸鈣。自20世紀(jì)以來，人工合成的磷酸鈣被大范圍的用于骨再生的臨床研究，此后，出現(xiàn)了大量骨再生應(yīng)用如骨水泥、支架、植入材料和磷酸鈣的涂層等，一些已經(jīng)商業(yè)化[5]。

為了確保生命系統(tǒng)和組織不應(yīng)發(fā)生炎癥或反應(yīng)排斥，每種可植入材料必須具有生物相容性，而研究發(fā)現(xiàn)磷酸鈣具有生物相容性，可能是因為它們可以溶解在體液中，并以固體形式大量存在[6]。磷酸鈣的性質(zhì)影響生物活性，如成骨細(xì)胞的粘附、增殖和新骨形成，而降解和釋放磷酸鈣離子對于呈現(xiàn)這些生物活性特征是非常重要的，這種情況增加了鈣和磷酸根離子的局部濃度進(jìn)而刺激骨礦物質(zhì)在磷酸鈣表面的形成[7]。它們還影響成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)，如COL1、ALP、BMPs、OPN、OCN、BSP、ON和RunX2[8]。磷酸鈣通過影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在表面的吸附作用，進(jìn)而在細(xì)胞粘附和組織形成中發(fā)揮重要作用，也通過影響新形成的骨礦物來影響骨再生[9]。

鈣離子在幾個方面影響細(xì)胞和生命系統(tǒng)，因為它是形成骨基質(zhì)的離子之一和骨組織中多以磷酸鈣的形式存在[10]。這些鈣離子通過鈣化作用引起骨的形成和成熟并且還通過細(xì)胞信號影響骨再生，機制是它通過一氧化氮的形成刺激成熟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)骨生長前體細(xì)胞進(jìn)行骨組織再生[11]。鈣離子還通過激活ERK1/2刺激成骨細(xì)胞骨合成途徑，并通過激活PI3K/Akt途徑延長成骨細(xì)胞的壽命[12]。此外，鈣離子還具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和吸收功能[13]。

磷離子大量存在于人體內(nèi)并與蛋白質(zhì)、核酸、三磷酸腺苷等多種物質(zhì)有關(guān)，影響著人的正常生理過程，超過80%的磷離子以磷酸鈣的形式與鈣離子一起存在于骨中[14]。磷酸鹽（PO43-）對組織形成和生長有很大影響，如磷酸鹽通過 IGF-1和ERK1/2通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和生長并增加BMPs的表達(dá)[15]。此外，磷酸在RANK配體及其受體信號之間具有負(fù)反饋作用，并調(diào)節(jié)RANK配體：OPG的比率以抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收[16]。

磷酸鈣的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)特性對于骨再生也很重要。骨誘導(dǎo)是誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞譜系的能力，而骨傳導(dǎo)是骨骼生長在材料表面的能力而骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)都支持細(xì)胞粘附和增殖[17]。細(xì)胞粘附力受細(xì)胞外基質(zhì)蛋白吸附能力的強烈影響也受磷酸鈣表面特性如表面粗糙度、結(jié)晶度、溶解性、相含量、孔隙率和表面能的影響[18]。

骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)受表面化學(xué)和表面電荷的影響，如它們影響蛋白質(zhì)吸附并且通過細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用發(fā)生成骨細(xì)胞分化[19]。磷酸鈣晶體結(jié)構(gòu)的粒度和粒徑?jīng)Q定它的作用，粗糙度影響磷酸鈣表面蛋白質(zhì)粘附和細(xì)胞粘附，而蛋白質(zhì)粘附性在粗糙度小于100 nm時得到加強[20]。

磷酸鈣的孔隙率對生物活性也有影響?？紫堵实脑黾痈纳屏似渑c表面區(qū)域上的體液的接觸導(dǎo)致溶解速率增加[21]。當(dāng)磷酸鈣的孔徑為20～500 μm時，蛋白質(zhì)吸附增強并且隨著孔數(shù)的增加吸附也會增強，孔徑大于100 μm會影響磷酸鈣的機械強度和形狀[22]。由于孔隙存在，磷酸鈣具有高脆性，低抗沖擊性和低拉伸應(yīng)力等機械性能，其抗壓強度優(yōu)于天然人骨，可以用于非承重植入物，缺陷填充等[23]。

親水性是成骨調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵因素，形成的親水表面對細(xì)胞吸附至關(guān)重要，可增加成纖維細(xì)胞的反應(yīng)，還可以增加骨細(xì)胞的成熟、分化以及骨整合并影響著細(xì)胞反應(yīng)[24]。此外，表面親水性增加了成骨細(xì)胞的粘附和增殖[25]。

磷酸鈣的溶解過程受每單位體積表面積，流體對流，酸度和溫度的影響。這決定了磷酸鈣的穩(wěn)定性和溶解性，通常溶解度與Ca/P離子的比例，純度，晶體大小和表面積成反比[26]。穩(wěn)定且低溶解度的磷酸鈣顯示出與其周圍環(huán)境的低離子交換和表面上的緩慢再結(jié)晶，從而通過帶電位點處的靜電相互作用確定蛋白質(zhì)濃度和構(gòu)象。另一方面，具有高溶解度的磷酸鈣容易改變局部pH和離子濃度，從而影響蛋白質(zhì)粘附[27]。

2 磷酸鈣的類型

磷酸鈣的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性來自其物理/化學(xué)特性，因此控制這些特性并選擇具有適合特定應(yīng)用的性質(zhì)的磷酸鈣是非常重要的，磷酸鈣的類型如圖1。

圖1 各晶體結(jié)構(gòu)示意圖

2.1 羥基磷灰石

羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HAP）廣泛用于骨再生，是一種天然形式的磷酸鈣，構(gòu)成人體骨骼中最大量的無機成分。HAP是天然形成的并且可以被收集，但是形成的結(jié)構(gòu)有缺陷，因此我們在實際研究或臨床應(yīng)用中使用的HAP是通過在水溶液系統(tǒng)中合成獲得的[28]。HAP是最穩(wěn)定的磷酸鈣，在溫度、pH、體液等生理環(huán)境中具有低溶解度，其表面可作為體液中骨礦物質(zhì)的成核位點，此外HAP在臨床應(yīng)用時不會引起炎癥反應(yīng)[29]。

HAP具有骨傳導(dǎo)性，但不具有骨誘導(dǎo)性。我們?yōu)榱俗屗哂形覀兿胍墓δ埽梢允褂梅?、氯、碳酸根離子等離子進(jìn)行替代達(dá)到我們的目的。例如，使用氟化物作為陰離子取代增加了它的穩(wěn)定性，使用鎂作為陽離子取代增加了它的生物效應(yīng)[30]。

HAP在骨再生中的臨床應(yīng)用研究始于20世紀(jì)80年代中期，主要用于種植體涂層和移植材料。盡管HAP已被用于臨床應(yīng)用，但由于其獨特的硬脆特性，尚未用于高負(fù)荷的組織，主要用作涂層[31]。例如，金屬植入物表面上的涂層改善了成骨細(xì)胞活性和植入物的生物相容性和生物活性。我們通過將HAP與諸如聚合物的軟材料混合來進(jìn)行骨再生應(yīng)用的研究，控制孔隙率，機械強度，生物活性和易用性來進(jìn)行合成支架的研究等[32]。

2.2 磷酸三鈣

磷酸三鈣（Tricalcium Phosphate，TCP）是目前研究最多的磷酸鈣之一，Ca/P比為1.5，分為α相和β相，α-TCP具有單斜晶系空間群的晶體結(jié)構(gòu)，β-TCP具有菱形空間群的晶體結(jié)構(gòu)，α-TCP可以在1125℃或更高溫度下形成，β-TCP在900℃～1100℃的溫度下形成[33]。 β-TCP具有比α-TCP更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更高的生物降解速率，因此β-TCP通常用于骨再生，而β-TCP不如HAP穩(wěn)定，但具有更快的降解速率、更高的溶解度和高吸收率，廣泛用于提高生物相容性[34]。β-TCP的納米多孔結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的生物礦化和細(xì)胞粘附，以至于它能促進(jìn)骨形成細(xì)胞如成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，目前β-TCP已被用于骨再生、骨水泥和骨替代[35]。

2.3 白磷鈣石

白磷鈣石（Whitlockite，WH）是一種含有鎂離子的磷酸鈣，它是人體骨骼中第二豐富的礦物質(zhì)，它的Ca/P比為1.43，具有菱形空間群的晶體結(jié)構(gòu)。WH在酸性條件下（pH＜4.2）具有高穩(wěn)定性并且表面帶負(fù)電荷，與HAP相比，它表現(xiàn)出更高的抗壓強度，而且它的溶解度在生理條件下更高，并且可以連續(xù)釋放更多的離子[36]。

以前WH合成非常困難，因此WH的研究進(jìn)展不順利。最近研究發(fā)現(xiàn)，WH可以很容易地在低溫條件下合成，當(dāng)Mg離子存在于含有磷酸鈣的酸性溶液中時，就會形成WH。此外，當(dāng)破骨細(xì)胞再吸收老骨時，通過酸性分子的釋放，在酸性條件下發(fā)生WH的體內(nèi)合成，WH誘導(dǎo)的成骨基因的表達(dá)高于HAP和β-TCP[37]。此外，復(fù)合水凝膠大鼠顱骨缺損模型的體內(nèi)骨再生顯示W(wǎng)H促進(jìn)生長和成骨活性優(yōu)于HAP。這些結(jié)果表明鎂和磷酸根離子的連續(xù)釋放通過控制成骨分化促進(jìn)骨生長，特別是鎂離子似乎會增加骨形成，因為它在降低破骨細(xì)胞的活性中發(fā)揮作用[38]。最近研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)WH和HAP以約1:3的比例共存時，成骨活性增加，WH的高成骨活性及其在天然骨中的作用預(yù)計將有助于未來對磷酸鈣材料的研究[39]。

3 磷酸鈣的應(yīng)用

盡管磷酸鈣作為原料本身已廣泛用于骨科，但許多研究者通過把磷酸鈣進(jìn)行加工以便更好地利用。它可以用作改善骨植入物生物活性的涂層材料，還被用作生物材料的復(fù)合材料，以改變機械性能、控制生物降解和包封藥物（圖2）。

圖2 基于磷酸鈣的應(yīng)用

3.1 涂層

磷酸鈣涂層可以應(yīng)用于各種材料以增強生物活性，主要使用溶膠-凝膠和電沉積方法進(jìn)行制備，它的研究主要針對金屬植入物應(yīng)用，目的是為了防止植入物腐蝕和提高生物活性[40]。有人在研究多孔和網(wǎng)狀磷酸鈣涂在鎂合金表面上的過程中發(fā)現(xiàn)，這種涂層技術(shù)提高了生物活性，細(xì)胞相容性，骨傳導(dǎo)性和成骨作用。實驗中將有該涂層的表面與常規(guī)鎂合金的表面進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)磷酸鈣包覆的鎂合金具有改善生物表面活性的作用。在成骨過程中，與未涂覆的鎂合金相比，觀察到骨生長因子BMP-2和TGF-β1的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異[41]。

有許多關(guān)于如何提高抗菌劑和生長因子有效性的研究正在積極研發(fā)中。Zhou等[42]為了減少感染并改善細(xì)胞-材料相互作用和抗微生物活性，他們使用激光工程凈成形方法在Ti金屬表面上涂覆AgNO3和TCP。通過對人成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測定，發(fā)現(xiàn)Ag-TCP包被的Ti顯示出細(xì)菌菌落的顯著減少。

3.2 骨水泥

磷酸鈣骨水泥主要用于填充和治愈骨缺損。骨水泥中主要摻入聚合物，如海藻酸鹽，甲殼素，殼聚糖，纖維素，明膠，膠原蛋白和合成聚合物，如聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG），聚乳酸-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA))，聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）和聚左乳酸(Poly-L-lactic acid，PLLA)等物質(zhì)，作為這些聚合物的復(fù)合物，磷酸鈣粘固劑能夠控制諸如可注射性、孔隙率、機械性能和降解速率等性能[43]。Hesaraki等[44]研究磷酸鈣骨水泥發(fā)現(xiàn)其具有改善注射性和流動性，可用于膀胱-腸內(nèi)反流疾病的尿道和骨缺損修復(fù)的微創(chuàng)手術(shù)，我們常將β-TCP糊劑與透明質(zhì)酸或PEG混合以制備磷酸鈣粘固劑。磷酸鈣粘固劑也存在一些問題，如骨再生率和降解率之間的差異、孔徑導(dǎo)致的長入限制、缺乏機械強度和合成聚合物的炎癥反應(yīng)。Ruhe等[45]研究了制備用于持續(xù)遞送重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）的PLGA和磷酸鈣復(fù)合物水泥，在該研究中，不同的pH和納米結(jié)構(gòu)條件下測量rhBMP-2釋放效應(yīng)發(fā)現(xiàn)該水泥可用于異位或原位部位的骨再生，Ohura等人制備磷酸一鈣一水合物（monocalcium phosphate monohydrate，MCPM）和β-TCP的混合水泥作為rhBMP-2的另一種載體時發(fā)現(xiàn)rhBMP-2移植的β-TCPMCPM作為rhBMP-2的載體對骨再生具有良好的效果。磷酸鈣骨水泥的脆性一直是磷酸鈣研究的一大難題，限制了它在臨床上非承重的應(yīng)用。Boehm等[46]通過對碳纖維表面進(jìn)行化學(xué)修飾來加固磷酸鈣骨水泥，發(fā)現(xiàn)它能夠改善它的彎曲強度和斷裂功能并且纖維增強不會影響 MG63（人成骨樣）細(xì)胞的細(xì)胞增殖和活性。使用化學(xué)修飾碳纖維增強磷酸鈣骨水泥是一種有前途的方法，可在這些骨水泥替代材料中獲得更好的力學(xué)性能，在一定程度上可用于承重應(yīng)用。

3.3 骨組織支架

磷酸鈣已經(jīng)與支架結(jié)合使用，如把藥物和生長因子封裝在支架內(nèi)[47]。Koempel等[48]發(fā)現(xiàn)通過將rhBMP-2連接到大孔陶瓷HAP支架上可以促進(jìn)HAP在宿主骨中的整合。他將支架植入兔顱骨缺損模型中，并在四周后觀察骨形成程度發(fā)現(xiàn)負(fù)載rhBMP-2的植入物顯示出更有效的骨形成，還發(fā)現(xiàn)rhBMP-2增強了骨整合，使HAP支架保持在適當(dāng)位置，證實BMP負(fù)載于大孔磷酸鈣支架上可促進(jìn)新骨形成，防止移位，最大限度地減少宿主骨吸收，降低感染和擠出的發(fā)生率。Farré-Guasch等[49]研究發(fā)現(xiàn)在磷酸鈣支架上添加脂肪干細(xì)胞可以刺激成骨，骨誘導(dǎo)和血管形成，表明使用基質(zhì)血管部分接種磷酸鈣支架的促血管生成作用。

3.4 活性藥物載體

CaP移植材料或涂層是骨科在實驗室和臨床試驗中常用的藥物載體。研究發(fā)現(xiàn)在治療效率和耐受性方面，與全身治療相比，局部施用活性劑（藥物，蛋白質(zhì)，基因，細(xì)胞等）具有顯著優(yōu)勢[50]。骨組織的再生是一個復(fù)雜的過程，需要細(xì)胞因子、激素和生長因子的參與下局部成骨。在骨感染、骨質(zhì)疏松或腫瘤發(fā)生等情況下，也需要抗生素、雙磷酸鹽以及抗腫瘤等藥物。

3.5 三維打印

3D打印是一種數(shù)字制造過程，其中幾何數(shù)據(jù)用于3D打印。支架結(jié)構(gòu)對骨再生至關(guān)重要，由于制造和材料科學(xué)的發(fā)展，客戶設(shè)計的具有微納米結(jié)構(gòu)的支架可以作為臨時基質(zhì)，為骨科手術(shù)中遇到的骨骼生長發(fā)育提供特定的環(huán)境和復(fù)雜的架構(gòu)?？梢允褂玫蜏鼗蚋邷?D打印的方法來制造CaP支架。在生物相關(guān)溫度下使用可改善印刷CaP支架機械性能的新型粘合劑或印刷技術(shù)是一個新興的研究領(lǐng)域。一個典型的印刷CaP支架具有量身定制的機械性能和相互連接的孔隙率可以成為一個未來的骨再生植入材料。例如，Cox等[51]報道在使用HA和聚乙烯醇(PVOH)復(fù)合粉末的3D打印互聯(lián)多孔支架過程中發(fā)現(xiàn)，HA：PVOH前體材料的流動性會影響3D打印支架的機械穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)和孔隙率，并且燒結(jié)過程可以加強去除PVOH熱降解產(chǎn)物的能力和權(quán)衡抗壓強度。Ahlfeld等[52]使用一種穩(wěn)定的糊狀CaP水泥制備了一種3D打印的CaP支架，發(fā)現(xiàn)其作為可延展的糊劑穩(wěn)定并且僅在與水溶液接觸后才開始固化反應(yīng)。后來他們在溫和的條件下通過雙通道繪圖制作了一個含有磷酸鈣骨水泥糊劑和高濃度VEGF負(fù)載的海藻酸鹽基水凝膠糊劑的雙相支架。顯微計算機斷層掃描顯示，即使在水凝膠鏈的膨脹狀態(tài)下，雙相支架內(nèi)也存在精確的鏈排列和相互連接的孔隙。雖然在控制支架結(jié)構(gòu)方面取得了可喜的結(jié)果，但3D打印CaP移植材料的臨床評價尚未獲得正式批準(zhǔn)，我們還需要更深入的臨床研究、架構(gòu)的優(yōu)化以及機械完整性、高制造成本、原材料的可行性和難以獲得監(jiān)管許可。不過，由于其在定制方面的意義，我們?nèi)钥梢詷酚^地認(rèn)為3D打印CaP支架在不久的將來獲得許可。

4 總結(jié)

總之，磷酸鈣的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特征影響細(xì)胞粘附，增殖和新骨形成。生物活性可以通過離子釋放和磷酸鈣的物理性質(zhì)來改變和控制，離子釋放影響著成骨細(xì)胞、組織和生理過程，物理性質(zhì)影響蛋白質(zhì)/細(xì)胞吸收，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨整合。隨著人們對磷酸鈣工藝的進(jìn)一步改進(jìn)，對其生物相容性研究的更加深入，相信磷酸鈣及其混合材料能為骨缺損和疾病的治療提供幫助。