微波輔助法提取淡豆豉中的多糖

郭婕，李季平

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口 466001）

淡豆豉是豆科植物大豆或黑豆成熟種子的發(fā)酵加工品，是我國(guó)的一種傳統(tǒng)健康食品，也是常用的藥食同源食物之一，可作為食品、保健食品的原料用于日常保健[1]，也可用于感冒、寒熱頭痛、煩虛不眠等病癥的治療[2-3]。王思齊等[4]認(rèn)為淡豆豉發(fā)酵生產(chǎn)的差異化是導(dǎo)致淡豆豉的藥性不同的主要原因。淡豆豉含大豆蛋白、維生素、多糖及大豆異黃酮等多種生物活性成分[5]。相關(guān)研究表明，淡豆豉多糖是淡豆豉中一種重要的生物活性成分，具有降血糖作用[6]，并對(duì)糖尿病小鼠的腎臟和胰腺有一定的修復(fù)作用[7]。如何有效地從淡豆豉中提取多糖，逐漸成為研究的焦點(diǎn)。因此，優(yōu)化淡豆豉多糖的提取工藝具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多糖提取的方法較多，較常用的是傳統(tǒng)的熱水浸提法，該法能夠最大限度地保持多糖的結(jié)構(gòu)和活性，但提取率低、耗時(shí)長(zhǎng)[8]。微波提取是利用微波能提取多糖的一種新技術(shù)，與傳統(tǒng)熱水浸提法相比，具有短時(shí)、快速、提取率高等特性，還可有效保護(hù)功能成分[9-10]。本研究利用微波輔助法從淡豆豉中提取多糖，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究料液比、微波處理時(shí)間、浸提溫度及微波功率對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化淡豆豉多糖的提取工藝，以提高淡豆豉多糖的提取率，為淡豆豉多糖的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡豆豉，購于同和堂大藥房。

無水葡萄糖、氯仿、正丁醇、無水乙醇、苯酚（AR.重蒸后使用）、98%濃硫酸、乙醚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鄰二氮菲、硫酸亞鐵銨及雙氧水等，均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室微波爐，南京杰全微波設(shè)備有限公司；SHB-III 循環(huán)水式真空泵，鄭州歐卡儀器設(shè)備有限公司；榮華HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LD5-2A低速臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；Spectrumlab 22PC 分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淡豆豉多糖提取工藝流程

提取工藝參考王婧杰等[11]提取紫椴花多糖的方法并略有改動(dòng)。將干燥的淡豆豉粉粹過40 目篩。稱取淡豆豉粉5 g，加蒸餾水浸泡0.5 h，微波提取兩次，抽濾，合并提取液。在提取液中加入氯仿：正丁醇（5：1）混合液，充分搖勻，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20 mL 左右。按照濃縮液：乙醇為1：3 的比例，在濃縮液中加入無水乙醇，攪拌均勻，靜置12 h 過夜。4 000 r/min 離心15 min，取沉淀，加適量乙醚洗滌沉淀，置于干燥箱內(nèi)低溫烘干，加蒸餾水定容至100 mL，得淡豆豉多糖提取液。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配置

稱取4 g 葡萄糖，加蒸餾水配成1 000 mL 的母液，加蒸餾水將母液稀釋100 倍，即為40 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考陳鈞輝等[12]編著的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材并略有改動(dòng)。分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 的40 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于各試管中，均加蒸餾水補(bǔ)至1 mL，然后各加入1 mL、6%苯酚溶液，搖勻，依次加入5 mL 濃硫酸，搖勻，置于40 ℃的水浴鍋中保溫30 min，冷卻，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度。將待測(cè)試管中葡萄糖的濃度（μg/mL）與吸光度作回歸處理，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：Y=0.186 6X＋0.029 2，R2=0.999 8。

1.3.4 淡豆豉多糖提取率的測(cè)定

取1 mL 稀釋樣品液，置于試管中，依照上述方法處理，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定其吸光度。按照公式（1）計(jì)算淡豆豉中多糖的提取率（%）。

式中：c 為樣品測(cè)定液多糖的濃度，μg/mL；V 為樣品提取液的體積，mL；K 為樣品測(cè)定液的稀釋倍數(shù)；W 為原料的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

利用微波提取法，以多糖含量為指標(biāo)，經(jīng)單因素試驗(yàn)初步考察料液比、微波處理時(shí)間、浸提溫度及微波功率四個(gè)因素對(duì)豆豉多糖提取率的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化

為了確定以上四個(gè)因素對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響大小，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交表進(jìn)一步優(yōu)化，確定淡豆豉多糖的最佳提取條件。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比的篩選

設(shè)置浸提溫度為50 ℃，微波功率為300 W，微波處理2 min，研究不同料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30（g：mL）對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溶劑的增加，淡豆豉多糖的提取率先升高后下降；料液比在1：20 時(shí)，淡豆豉多糖的提取率最高，為0.58%。提取劑過少時(shí)，多糖溶出量低；隨著提取劑增加，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓降低，當(dāng)降低到一定程度時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的遷移[13]；且提取劑過多，會(huì)相應(yīng)增加濃縮時(shí)間，易導(dǎo)致糖鏈在高溫下斷裂，使得提取率下降。故料液比初步選擇1：20。

圖1 料液比對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

2.1.2 微波處理時(shí)間的篩選

設(shè)置料液比1：20，浸提溫度50 ℃，微波功率300 W，研究不同微波處理時(shí)間1、2、3、4、5 min 對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，微波處理時(shí)間在5 min 之內(nèi)，豆豉多糖提取率隨時(shí)間增加先升高后下降；微波時(shí)間在3 min 時(shí)，多糖提取率最高，為0.71%。主要原因可能是短時(shí)間內(nèi)微波輻射對(duì)細(xì)胞的破壞能力強(qiáng)，使有效成分的分子運(yùn)動(dòng)加劇，擴(kuò)散速度增加，多糖溶出較多；但隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度上升，多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，含量也相應(yīng)的減少，這與王娟等[14]的研究結(jié)果一致。故微波時(shí)間初步選擇3 min。

圖2 微波處理時(shí)間對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave-heating time on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

2.1.3 浸提溫度的篩選

設(shè)置料液比1：20，微波功率300 W，微波處理3 min，研究不同浸提溫度50、60、70、80、90 ℃對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3（見下頁）所示。由圖3 可知，浸提溫度為70 ℃時(shí)，淡豆豉多糖的提取率最高，為0.83%。溫度過低，溶劑的滲透能力和溶解能力不夠，多糖不能有效溶出；但溫度過高易造成溶液暴沸而溢出，不利于提取[15]，且還會(huì)使較多的雜質(zhì)溶出，增加分離難度[16]。故浸提溫度選擇70 ℃。

2.1.4 微波功率的篩選

設(shè)置料液比1：20，浸提溫度70 ℃，微波處理3 min，研究不同微波功率150、300、450、600、750 W 對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4（見下頁）所示。由圖可知，在一定范圍內(nèi)，淡豆豉多糖提取率隨著微波功率的增加先升高后下降，當(dāng)微波功率達(dá)到450 W 時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高，為0.95%。隨著微波功率的增加，細(xì)胞的破壞程度加大，多糖提取率升高；但微波功率過大時(shí)，細(xì)胞的破碎至一定程度，反而對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的選擇加熱差異減小，使多糖提取率下降[17]。故微波功率初步選擇450 W。

圖3 浸提溫度對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

圖4 微波功率對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction yield of polysaccharide from semen sojae praeparatum

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）極差分析可知，影響淡豆豉多糖提取率的因素主次順序?yàn)锽>A>D>C，即微波處理時(shí)間>料液比>微波功率>浸提溫度。表3 顯示了各因素對(duì)淡豆豉多糖提取率均有一定影響，其中微波處理時(shí)間表現(xiàn)顯著（P<0.05）。淡豆豉多糖的最佳提取條件為A2B2C3D3，即料液比1：20（g：mL）、微波處理3 min、浸提溫度為80 ℃、微波功率為600 W。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，按照最佳提取工藝條件組合，重復(fù)3 次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得淡豆豉多糖的提取率分別為1.05%、1.01%、1.02%。故在最佳提取工藝條件下，淡豆豉多糖的提取率為1.03%±0.02%。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34) orthogonal test

表3 提取率方差分析Table 3 Variance analysis of the extraction yield

3 結(jié)論

通過單因素及L9(34)正交試驗(yàn)，分析料液比、微波處理時(shí)間、浸提溫度及微波功率對(duì)淡豆豉多糖提取率的影響，并優(yōu)化最佳微波提取條件。經(jīng)極差及方差分析可知，影響豆豉多糖提取率的因素主次順序?yàn)槲⒉ㄌ幚頃r(shí)間>料液比>微波功率>浸提溫度，其中微波處理時(shí)間的影響最大。淡豆豉多糖的最佳提取條件為料液比1：20（g：mL）、微波處理3 min、浸提溫度為80 ℃、微波功率為600 W，在此條件下，豆豉多糖的提取率為1.03%±0.02%，為進(jìn)一步研究豆豉中多糖的純化、生物活性及產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。