魚類III型Myosin基因家族成員的表達(dá)和功能研究*

趙呈天， 陳 哲， 馮 東

(中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003)

肌球蛋白(Myosin)是一個(gè)由多成員組成的超家族，對其最早的研究來源于骨骼肌細(xì)胞中II型肌球蛋白分子。人類細(xì)胞中存在超過40種肌球蛋白，分屬于12個(gè)不同的家族[1]。肌球蛋白家族成員之間差異較大，但都可以分成頭部、頸部和尾部三部分。肌球蛋白的頭部是與運(yùn)動相關(guān)的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)在不同肌球蛋白成員間高度保守，是肌球蛋白分類的依據(jù)。肌球蛋白的頸部是連接頭部和尾部的一段α螺旋，可以結(jié)合肌球蛋白輕鏈和鈣調(diào)蛋白，來發(fā)揮其杠桿的作用。而肌球蛋白的尾部差異性較大，主要與其選擇性結(jié)合的“貨物(Cargo)”有關(guān)[1]。根據(jù)各種肌球蛋白的分子結(jié)構(gòu)差異，一般將II型肌球蛋白稱為經(jīng)典肌球蛋白，其它的稱為非經(jīng)典肌球蛋白。其中，經(jīng)典的肌球蛋白主要存在于肌細(xì)胞中，參與肌肉收縮等活動。非經(jīng)典的肌球蛋白則在膜泡運(yùn)輸、細(xì)胞極性建立、細(xì)胞膜突起形成等過程中發(fā)揮功能[2-3]。

研究表明，一些非經(jīng)典肌球蛋白基因的突變，會導(dǎo)致毛細(xì)胞的功能異常以致聽力的喪失[4-8]。例如，肌球蛋白MyoXVa與包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白whirlin以及肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白Eps8形成一個(gè)定位于聽纖毛(Stereocilia)頂端的復(fù)合體，其功能異常會導(dǎo)致小鼠內(nèi)耳聽纖毛變短以及聽覺的異常[4-5]。而肌球蛋白MyoⅦa作為Usher I型綜合征(Usher syndrome type I, USH1)的致病基因，與USH1家族的其它成員形成復(fù)合體，共同參與內(nèi)耳纖毛束的形態(tài)發(fā)生[6-8]。

脊椎動物的III型Myosin蛋白也屬于非經(jīng)典的肌球蛋白，包含Myo3a和Myo3b兩個(gè)成員。研究表明，這兩個(gè)成員均在內(nèi)耳耳蝸處表達(dá)[9-10]，其中Myo3a基因的突變，會導(dǎo)致人常染色體隱形非綜合征性耳聾的發(fā)生[11-13]。小鼠中的研究表明，Myo3b基因的缺失并不會導(dǎo)致明顯異常，而Myo3a基因缺失會導(dǎo)致聽力喪失，且雙突變小鼠的耳聾表型更加嚴(yán)重[10]。進(jìn)一步研究表明，上述表型的產(chǎn)生可能與Myo3a，Myo3b以及其所運(yùn)輸?shù)牡鞍譋spin-1的相互作用有關(guān)[14-16]。III型Myosin蛋白除了在耳蝸處定位以外，在眼睛的感光細(xì)胞中也有表達(dá)[17-18]。小鼠中的免疫染色結(jié)果表明，Myo3a和Myo3b在所有感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)段均有定位[19]。同時(shí)，魚類中的研究表明，III型Myosin蛋白在視網(wǎng)膜中有表達(dá)，且在感光細(xì)胞中有定位[20]。這些結(jié)果均暗示III型Myosin蛋白可能在感光細(xì)胞中也發(fā)揮一定功能。

目前，對III型Myosin蛋白的研究主要集中在細(xì)胞以及小鼠中，其在魚類胚胎發(fā)育過程中的功能仍未見報(bào)導(dǎo)。與小鼠等哺乳動物相比，魚類雖然在進(jìn)化地位上較低等，但仍然具有一定的優(yōu)勢。首先，眼睛和內(nèi)耳的發(fā)育在不同物種間相對保守，魚類視網(wǎng)膜及感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成與人類有很高的相似性；其次，雖然魚類不具有哺乳動物的外耳和耳蝸等結(jié)構(gòu)，但是具有類似的毛細(xì)胞和纖毛等結(jié)構(gòu)，且與哺乳動物十分相似[21]。因此研究Myosin蛋白在魚類胚胎發(fā)育中的功能對研究毛細(xì)胞及感光細(xì)胞的發(fā)育及進(jìn)化機(jī)制具有一定的幫助。

斑馬魚(Daniorerio)是一種典型硬骨魚類，具有飼養(yǎng)周期短、繁殖力強(qiáng)、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)其遺傳操作較為方便，在研究基因進(jìn)化功能方面具有顯著優(yōu)勢[22]。本研究中，以模式魚種斑馬魚為例，報(bào)導(dǎo)了III型Myosin基因家族成員在魚類胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)模式及功能。首先利用整胚原位雜交技術(shù)確定斑馬魚myo3a和myo3b基因的時(shí)空表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)myo3a和myo3b在10體節(jié)之前均無表達(dá)。在受精后24 h的胚胎中，myo3a在腦部中表達(dá)，myo3b在神經(jīng)管腹部腦脊液接觸的神經(jīng)元中表達(dá)，此外二者共同在內(nèi)耳中表達(dá)。其次利用CRISPR/Cas9技術(shù)對myo3a和myo3b基因進(jìn)行敲除并對突變體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)myo3a和myo3b的單獨(dú)缺失對斑馬魚胚胎發(fā)育并沒有影響。進(jìn)一步，通過對雙突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雙突變存在眼睛變小，魚鰾不能形成等現(xiàn)象，同時(shí)內(nèi)耳毛細(xì)胞聽覺纖毛顯著變短，表明III型Myosin蛋白在斑馬魚發(fā)育過程中發(fā)揮功能。

1. 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

本研究中所使用的斑馬魚均為Tübingen品系。0～5 dpf (Days post fertilization, 受精后天數(shù))的斑馬魚胚胎置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每天更換E3培養(yǎng)液(5 mmol/L NaCl, 0.17 mmol/L KCl, 0.33 mmol/L CaCl2, 0.33 mmol/L MgSO4)。5～30 dpf的幼魚放置在魚苗培養(yǎng)器中培養(yǎng)，每天喂養(yǎng)適量的草履蟲，并且根據(jù)幼魚的大小適量加入新鮮的豐年蝦。30 dpf以上的斑馬魚養(yǎng)殖在28.5 ℃恒溫水循環(huán)系統(tǒng)中，每天喂養(yǎng)適量的新鮮豐年蝦兩次，魚房保持14 h光照/10 h黑暗周期。

1.2 整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)

從斑馬魚的cDNA中擴(kuò)增myo3a和myo3b基因特異的片段，基因信息獲取自NCBI網(wǎng)站(myo3a: AF384863.1;myo3b:XM_001920252.7)，并通過Oligo 7軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，序列如下：myo3a-F: 5’-TCCACCCCTGAAGAAATGAC-3’,myo3a-R: 5’-GCTTTGCCCTCCTCCTGTTG-3’;myo3b-F: 5’-TCAACATCGCTAACGAACAG-3’，myo3b-R: 5’-CGACCACCATCTTGGACAG-3’。擴(kuò)增的片段連接至pEASY-T3載體(全式金，貨號：CT301)，測序后根據(jù)片段插入方向選擇相應(yīng)的RNA聚合酶，合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針待用。實(shí)驗(yàn)中urp1和pkd2l1探針信息參考之前的工作[23]。

整胚原位雜交采用標(biāo)準(zhǔn)流程，簡略如下：第一天，將保存在甲醇中的胚胎梯度水化至PBST，經(jīng)多聚甲醛固定及蛋白酶K(Boehringer，貨號：1000144)處理后，加入HYB-雜交液(50%甲酰胺，5×SSC，0.1% Tween-20)，64 ℃孵育5 min，之后用HYB+雜交液(HYB-，0.5 mg/mL酵母 tRNA, 0.05 mg/mL肝素)進(jìn)行預(yù)雜交，最后加入探針64 ℃孵育過夜；第二天吸去探針，分別用50%甲酰胺/2×SSCT、2×SSCT、0.2×SSCT于64 ℃梯度洗脫，然后加入封閉液(10%山羊血清，2% Block reagent，MABT)室溫封閉1 h，最后加入偶聯(lián)堿性磷酸酶的地高辛抗體(Roche，貨號：11093274910)，4 ℃孵育過夜；第三天吸去抗體，經(jīng)MABT多次洗脫后，用BM purple顯色液顯色(Roche，貨號：11442074001)。

雙熒光原位雜交中，第二天抗體孵育時(shí)，加入偶聯(lián)過氧化物酶的地高辛抗體(Roche，貨號：11207733910)。第三天顯色時(shí)使用TSA放大顯色液(PerkinElmer, 貨號：NEL744E001KT)室溫顯色2 h，PBST清洗后梯度替換至甲醇中，使用1%過氧化氫/甲醇處理胚胎30 min后梯度替換至PBST中。并用PBST、MABT清洗胚胎，然后加入封閉液室溫封閉1 h后，加入偶聯(lián)過氧化物酶的熒光素抗體(Roche，貨號：11426346910)4 ℃孵育過夜。第四天吸去抗體，按照第三天的步驟洗去多余抗體后進(jìn)行顯色。顯色后的胚胎保存于PBST中，使用徠卡SP8共聚焦顯微鏡拍照記錄。

1.3 基因敲除及突變體篩選

本實(shí)驗(yàn)中使用CRISPR/Cas9技術(shù)對myo3a和myo3b基因進(jìn)行了敲除，靶位點(diǎn)如下：myo3a-target: 5’-ACAGAGGTGCGGGACGCCAT-3’，myo3b-target: 5’-ATGTTTCTTCAGAAGCCCA-3’。突變體檢測引物如下：myo3a-P5: 5’-TATGCAGCACCCGCTTATC-3’,myo3a-P3: 5’-CAATAGCCCCAGCAAATAAG-3’;myo3b-P5: 5’-CATCAGTTATTTGCTCAGGGAG-3’,myo3b-P3: 5’-GCTAATCAAAAGGAGAAGTCGG-3’。

1.4 免疫組化

整胚免疫組化步驟如下：選取發(fā)育至5 dpf的斑馬魚胚胎，用4%多聚甲醛4℃固定過夜后，PBST、雙蒸水各洗2次，每次5 min。之后加入預(yù)冷的丙酮于-20 ℃通透10 min。然后用雙蒸水洗2次、PBST洗2次。用封閉液(2%山羊血清，1%BSA, 1% DMSO，PBST)室溫封閉1 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。第二天吸去一抗，用PBD(1%BSA, 1%DMSO，PBST)洗4次，每次30 min，之后加入二抗，4 ℃避光孵育過夜。然后吸去二抗，用PBD洗4次，每次30 min，PBST洗2次，每次5 min。之后使用徠卡SP8共聚焦顯微鏡拍照記錄。實(shí)驗(yàn)中使用的抗體比例：乙酰化微管蛋白抗體為小鼠單抗(Sigma, 貨號：T6793，1∶500)，鬼筆環(huán)肽(Invitrogen, 貨號：A12379，1∶100)，二抗為GAM546(ThermoFisher，貨號：A11018, 1∶500)。

2 結(jié)果

2.1 整胚原位雜交揭示myo3a和myo3b的時(shí)空表達(dá)模式

為了研究斑馬魚中myo3a和myo3b基因的表達(dá)情況，選取胚盾期(Shield)、尾芽期(Bud)、5體節(jié)，10體節(jié)以及發(fā)育24 h時(shí)的胚胎進(jìn)行整胚原位雜交。結(jié)果表明，myo3a和myo3b在10體節(jié)期之前均沒有明顯表達(dá)(見圖1A、E, 部分?jǐn)?shù)據(jù)未展示)。在24 hpf胚胎中，myo3a主要在腦部表達(dá)，并在端腦和間腦處高表達(dá)，同時(shí)在內(nèi)耳部位可見明顯染色，在72 hpf的胚胎中，其表達(dá)仍集中在腦部(見圖1B～D)。myo3b的表達(dá)起始于14體節(jié)左右，在胚胎發(fā)育到24 hpf時(shí)，其表達(dá)主要集中在內(nèi)耳以及腹部神經(jīng)管區(qū)域，胚胎發(fā)育至72 hpf時(shí)內(nèi)耳中仍有表達(dá)(圖1F～H, 部分?jǐn)?shù)據(jù)未展示)。

為進(jìn)一步研究myo3b的表達(dá)模式，分別檢測了該基因與腹部腦脊液接觸神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記基因urp1，pkd2l1的表達(dá)共定位情況[23]。雙熒光原位雜交染色結(jié)果表明，myo3b的表達(dá)與urp1有部分重合(見圖1I～K)，而與pkd2l1的表達(dá)基本重合(見圖1L～N)，表明myo3b可能在與腦脊液接觸的神經(jīng)元中發(fā)揮功能。

2.2 myo3b的基因敲除及突變體表型分析

對myo3a和myo3b基因的表達(dá)分析表明，與人、小鼠類似，二者均在斑馬魚內(nèi)耳中有表達(dá)，暗示其在內(nèi)耳發(fā)育中發(fā)揮一定的功能。同時(shí)，myo3b在腦脊液接觸神經(jīng)元中高表達(dá)，說明其可能參與調(diào)控了該神經(jīng)元的生理活動。為進(jìn)一步研究其功能，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了相關(guān)突變體。

((A～H)myo3a和myo3b在10體節(jié)期(10 s)、24和72 hpf的原位雜交結(jié)果。Te: 端腦，Di：間腦，Ov: 耳泡。(I-N)24 hpf胚胎的urp1、pkd2l1和myo3b的雙熒光原位雜交結(jié)果。比例尺=10 μm。(A～H) Whole mount in situ hybridization results ofmyo3aandmyo3bat 10-somite stage (10 s), 24 hpf and 72 hpf. Te: Telencephalon, Di: Diencephalon, Ov: Otic vesicle. (I～N) Double fluorescence in situ hybridization results ofurp1,pkd2l1andmyo3bat 24 hpf. Scale bar=10 μm.)

圖1myo3a和myo3b在斑馬魚中的表達(dá)圖譜

Fig.1 Expression pattern ofmyo3aandmyo3bin zebrafish

斑馬魚myo3b基因有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中最長的轉(zhuǎn)錄本包含35個(gè)外顯子，開放閱讀框全長為3 816 bp，編碼1 272個(gè)氨基酸。myo3b基因的Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)在第21個(gè)外顯子上，為兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本共享外顯子，該區(qū)域編碼斑馬魚Myo3b蛋白的動力結(jié)構(gòu)域。通過篩選，獲得了缺失2 bp的突變體，該突變破壞了原基因組的NcoI酶切位點(diǎn)(見圖2A～D)，對兩種轉(zhuǎn)錄本均造成閱讀框移碼以及翻譯的提前終止。同時(shí)，qPCR和原位雜交結(jié)果顯示，突變體中myo3b的表達(dá)量明顯下調(diào)(見圖2E、F)，表明在突變體中發(fā)生了無義mRNA導(dǎo)致的降解現(xiàn)象[24-25]。

接著，對突變體胚胎早期的發(fā)育過程進(jìn)行分析。首先，熒光原位雜交結(jié)果顯示，myo3b突變體中腦脊液接觸神經(jīng)元的標(biāo)記基因urp1和pkd2l1的表達(dá)無明顯變化，表明myo3b的缺失不影響該神經(jīng)元的形成(見圖2F)。之后，利用抗乙?；⒐艿鞍椎目贵w對內(nèi)耳毛細(xì)胞的動纖毛(Kinocilia)進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，myo3b突變體中內(nèi)耳Crista和Macula的動纖毛無明顯異常(見圖3A、B)。同時(shí)，利用鬼筆環(huán)肽對內(nèi)耳Crista和Macula中肌動蛋白組成的聽纖毛(Stereocilia)進(jìn)行染色，也沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常(見圖3A、B)。此外，純合突變體成魚可以存活并正常傳代，表明myo3b基因的單獨(dú)缺失不影響斑馬魚胚胎的發(fā)育。

((A)myo3b的基因組結(jié)構(gòu)。(B)野生型及突變體基因序列信息及突變位點(diǎn)導(dǎo)致的NcoI酶切位點(diǎn)變化。(C)野生型，雜合體以及純合突變體NcoI酶切的電泳結(jié)果，野生型的PCR產(chǎn)物(525 bp)可以被切成385和140 bp兩個(gè)片段，而純合突變體無法切開。(D)Myo3b蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖，箭頭指示突變位點(diǎn)在蛋白上對應(yīng)的位置。(E)qPCR結(jié)果顯示24 hpf野生型及myo3b突變體胚胎中myo3b基因的相對表達(dá)量。(F)24 h野生型和myo3b突變體中myo3b、urp1和pkd2l1熒光原位雜交結(jié)果。比例尺=10 μm。WT：野生型。(A) Genomic structure ofmyo3b. (B) Sequences of wild type (WT) and mutant alleles. TheNcoI restriction site of the wild type allele is also labeled. (C) Genotype results of wild type, heterozygote and homozygote embryos. In wild type allele, the 525 bp PCR products can be digested into 385 bp and 140 bp fragments. (D) Diagram showing the structure domains of Myo3bprotein. Arrow indicates the position of the mutation site. (E) qPCR results showing relative expression ofmyo3bin 24 hpf wild type andmyo3bmutants. (F) Fluorescence in situ hybridization results ofmyo3b,urp1 andpkd2l1 in wild type ormyo3bmutant embryos. Scale bar=10 μm.WT:Wild type.)

圖2myo3b突變體的構(gòu)建及表型分析

Fig.2 Generation and phenotypic analysis ofmyo3bmutant

2.3 myo3a的基因敲除及突變體表型分析

myo3b突變體發(fā)育無顯著異常，本研究推測可能是由于Myo3a功能冗余所造成。為此，進(jìn)一步對myo3a基因進(jìn)行了敲除。斑馬魚myo3a基因有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中最長的轉(zhuǎn)錄本包含38個(gè)外顯子，開放閱讀框全長為5 325 bp，編碼1 775個(gè)氨基酸。在3個(gè)轉(zhuǎn)錄本共享的第19外顯子上設(shè)計(jì)了Cas9靶位點(diǎn)(見圖4A、B)。通過篩選，獲得了缺失5 bp的突變體，該突變破壞了此處的NcoI酶切位點(diǎn)，造成移碼突變，導(dǎo)致編碼的Myo3a蛋白的動力結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)異常(見圖4A～D)

與myo3b突變體類似，myo3a的突變體也可正常發(fā)育，對其內(nèi)耳處纖毛的染色結(jié)果表明該突變體中Crista和Macula的纖毛基本正常(見圖4E、F)，同時(shí)鬼筆環(huán)肽的染色也沒有發(fā)現(xiàn)差異(見圖4E、F)，這一結(jié)果與小鼠突變體并不完全相同[10]。

((A)內(nèi)耳Crista毛細(xì)胞染色結(jié)果。(B)內(nèi)耳Macula毛細(xì)胞染色結(jié)果。紅色為抗乙?；⒐艿鞍卓贵w所標(biāo)記的動纖毛，綠色代表鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的聽纖毛。比例尺=10 μm。(A) Immunostaining results of inner ear crista hair cells. (B) Immunostaining results of inner ear macula hair cells. Red channel shows kinocilia visualized by anti-acetylated α-tubulin antibody, green channel shows stereocilia visualized with phalloidin. Scale bar=10 μm.)

圖3 受精后5天的野生型及myo3b突 變體內(nèi)耳毛細(xì)胞表型分析

Fig.3 Phenotypes of inner ear hair cells of 5 dpf wild type andmyo3bmutants

2.4 myo3a和myo3b雙突變的表型分析

由于myo3a和myo3b突變體均無明顯的發(fā)育異常，進(jìn)一步將兩個(gè)突變體進(jìn)行雜交并篩選得到了雙突變體。與野生型胚胎相比，雙突變體胚胎的眼睛顯著變小(p<0.001),同時(shí)魚鰾不能充氣(見圖5A、B)。進(jìn)一步免疫組化結(jié)果表明，雙突變體視網(wǎng)膜分層并無明顯異常，感光細(xì)胞形態(tài)也基本正常，表明雙突變僅延緩了視網(wǎng)膜整體的發(fā)育進(jìn)程(見圖5 C)。最后，對雙突變胚胎的內(nèi)耳毛細(xì)胞進(jìn)行了研究，染色結(jié)果表明內(nèi)耳Crista的動纖毛變短，同時(shí)鬼筆環(huán)肽所標(biāo)記的聽纖毛也變短(見圖5D、E)。以上結(jié)果表明，Myo3a和Myo3b在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮功能，同時(shí)其在調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞聽纖毛發(fā)育方面也具有一定的進(jìn)化保守性。

((A)myo3a的基因組結(jié)構(gòu)。(B)野生型及突變體基因序列信息及相應(yīng)的NcoI酶切位點(diǎn)。(C)野生型，雜合體以及純合突變體NcoI酶切的電泳結(jié)果，野生型PCR產(chǎn)物(596 bp)可以被切成422和174 bp片段，而純合突變體無法切開。(D)Myo3a蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖，箭頭指示突變位點(diǎn)在蛋白上對應(yīng)的位置。(E)內(nèi)耳Crista纖毛染色。(F)內(nèi)耳Macula纖毛染色。紅色為抗乙?；⒐艿鞍卓贵w染色，綠色代表鬼筆環(huán)肽染色。比例尺=10 μm。(A) Genomic structure ofmyo3a. (B) Sequences of wild type and mutant alleles. TheNcoI restriction site of the wild type allele is also labeled. (C) Genotype results of wild type, heterozygote and homozygote embryos. In wild type allele, the 596 bp PCR product can be digested into 422 bp and 174 bp fragments. (D) Diagram showing the structure domains of Myo3aprotein. Arrow indicates the position of mutation site. (E) Immunostaining results of crista hair cells; (F) Immunostaining results of macula hair cells. The red and green channels are the same as
Fig. 3 Scale bar=10 μm.)

圖4myo3a突變體構(gòu)建及內(nèi)耳纖毛染色

Fig.4 Phenotype ofmyo3amutants

((A)野生型及myo3a/myo3b雙突變體外觀圖，箭頭指示魚鰾。(B)野生型和myo3a/myo3b雙突變胚胎眼睛面積統(tǒng)計(jì)。(C)野生型和myo3a/myo3b雙突變眼睛免疫染色結(jié)果。紅色由zpr-1抗體標(biāo)記雙錐細(xì)胞，綠色由鬼筆環(huán)肽標(biāo)記，藍(lán)色由DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。(D)內(nèi)耳Crista纖毛染色。紅色由乙?；⒐艿鞍卓贵w標(biāo)記，綠色由鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。(E)野生型及突變體內(nèi)耳Crista聽纖毛長度統(tǒng)計(jì)。比例尺=10 μm，***，p<0.001。(A) External phenotype of wild type andmyo3a/myo3bdouble mutants. Arrows indicate the swim bladder of wild type larva. (B) Statistical results of the eye size in wild type ormyo3a/myo3bdouble mutants. (C) Immunostaining results of sections through the central retinae of wild type andmyo3a/myo3bdouble mutants. Staining with zpr-1 antibody is showed in red, phalloidin is showed in green, nucleus is labeled with DAPI in blue. (D) Immunostaining results of the inner ear crista. Staining with anti-acetylated α-tubulin antibody is showed in red, and stereocilia is labeled with phalloidin in green. (E) Dotted plots of the length of stereocilia in the inner ear crista of wild type and double mutants. Scale bar=10 μm.***,p<0.001.)

圖5myo3a/myo3b雙突變表型分析

Fig.5 Phenotypes ofmyo3a/myo3bdouble mutants

3 討論

本文中首次對斑馬魚III型Myosin基因家族成員myo3a和myo3b進(jìn)行了研究。整胚原位雜交結(jié)果顯示myo3a及myo3b均在斑馬魚的內(nèi)耳中表達(dá)，暗示二者在調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育過程中有一定的功能。在對這兩個(gè)基因進(jìn)行敲除后，發(fā)現(xiàn)myo3a或myo3b的單獨(dú)缺失對內(nèi)耳發(fā)育無顯著影響，但在雙突變胚胎中，內(nèi)耳Crista聽纖毛的發(fā)育存在明顯異常，表明二者功能存在冗余。這一點(diǎn)在小鼠中也有類似結(jié)論，例如小鼠Myo3b突變體聽纖毛無明顯異常，Myo3a的突變體僅有輕微聽覺障礙，而雙突變小鼠聽力顯著下降，主要原因是因?yàn)閮?nèi)耳聽纖毛排列異常所導(dǎo)致[10]。

但目前僅發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳Crista毛細(xì)胞中存在發(fā)育異常現(xiàn)象，Macula纖毛并未發(fā)現(xiàn)明顯異常。推測斑馬魚等硬骨魚類存在基因擴(kuò)增現(xiàn)象導(dǎo)致的基因功能冗余，可能是對這種現(xiàn)象的一種解釋。雖然僅僅鑒定出該家族的Myo3a及Myo3b兩個(gè)成員，不排除該家族中有未知成員的存在，同時(shí)其它Myosin家族也在內(nèi)耳中高表達(dá)[26]，可能在魚類內(nèi)耳中發(fā)揮更重要的功能。

有趣的是，myo3b基因除了在斑馬魚內(nèi)耳中有表達(dá)之外，在24 hpf胚胎的神經(jīng)管中也有十分特異的表達(dá)，且該表達(dá)模式與pkd2l1基因基本一致。pkd2l1主要在腦脊液接觸的神經(jīng)元中表達(dá)，在調(diào)控胚胎運(yùn)動方面發(fā)揮重要功能[27]，這些結(jié)果暗示Myo3b可能在調(diào)控該神經(jīng)元的發(fā)育以及胚胎運(yùn)動方面發(fā)揮作用。近期的一篇研究結(jié)果也指出Myo3b可能定位在該神經(jīng)元接觸腦脊液一側(cè)的“花環(huán)”狀結(jié)構(gòu)中[28]，這一點(diǎn)也與本研究的結(jié)果一致。雖然urp1以及pkd2l1在myo3b突變體中表達(dá)無明顯異常，但該腦脊液神經(jīng)元的生理功能可能受到了影響，未來利用膜片鉗等方法研究雙突變體中該神經(jīng)元的生理功能以及其所調(diào)控的胚胎運(yùn)動缺陷機(jī)制是一個(gè)重要研究方向。