乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL對(duì)冷鮮雞肉中單增李斯特菌抑制效果研究

吳學(xué)友陳正行鞠興榮,2,3

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023； 3. 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

中國(guó)是肉品生產(chǎn)大國(guó)也是消費(fèi)大國(guó)，國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布數(shù)據(jù)[1-5]顯示，2014～2018年中國(guó)肉類總產(chǎn)量分別為8.707×107，8.625×107，8.540×107，8.431×107，8.517×107t，其中禽肉產(chǎn)量分別占20.11%，21.17%，22.11%，22.50%，23.41%，禽肉在中國(guó)肉品消費(fèi)中占比逐年上升。目前，中國(guó)消費(fèi)的生肉主要以熱鮮肉、冷鮮肉和冷凍肉3種形式供應(yīng)市場(chǎng)[6]。其中，冷鮮肉因具有質(zhì)地柔軟、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、汁液損失少等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在消費(fèi)市場(chǎng)上越來(lái)越受消費(fèi)者青睞[7]。一般情況下，健康禽畜的肉質(zhì)是無(wú)菌肉，然而在經(jīng)歷禽畜屠宰、胴體清洗分割、肉品加工等肉類工業(yè)生產(chǎn)流通環(huán)節(jié)，肉的表層極易受到有害微生物的污染，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失與腐敗，破壞肉的感官品質(zhì)，傳播食源性疾病，危害人們的營(yíng)養(yǎng)和健康[8-9]。因有害微生物污染肉及其制品引起的公眾食品安全事件層出不窮，一直是社會(huì)輿論的焦點(diǎn)[10]。

微生物污染是中國(guó)乃至全球食品安全的首要問(wèn)題。冷鮮肉在生產(chǎn)加工流通中不可避免受到環(huán)境和動(dòng)物腸道、表皮等微生物的侵染，常見(jiàn)的有大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌等病原微生物[11-14]。其中，李斯特菌在自然環(huán)境中分布極為廣泛，特別是可食用的肉類、禽類、蛋類、乳制品、蔬菜等都是其良好的宿主[15-16]。李斯特菌具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，即使在4 ℃的冷藏環(huán)境下仍可生長(zhǎng)繁殖[17]，而且通常的熱加工處理不能完全殺滅該病原微生物[18]。該菌屬中的單增李斯特菌是一種危害性非常嚴(yán)重的病原菌，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)和單核細(xì)胞增多等，由它引起的李斯特菌病致死率超過(guò)25%[16]。近年來(lái)，世界各地爆發(fā)多起單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件，使得李斯特菌成為了研究食品安全防控的熱點(diǎn)[19-20]。為此，抑制李斯特菌的生長(zhǎng)，控制其對(duì)食品的污染，對(duì)保障食品質(zhì)量安全具有至關(guān)重要的現(xiàn)實(shí)意義[21]。

由于李斯特菌在冷藏溫度下仍可以生長(zhǎng)繁殖，這是目前冷鮮肉加工儲(chǔ)藏中的難點(diǎn)問(wèn)題，因此，亟需尋求控制冷鮮肉中李斯特菌生長(zhǎng)的有效方法。細(xì)菌素是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或者多肽，其對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度低、效率高的特點(diǎn)[22-25]，且在人體內(nèi)可被降解，具有無(wú)毒、無(wú)殘留、高效、耐酸、耐高溫、無(wú)抗藥性等特點(diǎn)[26-27]。在對(duì)化學(xué)防腐劑的安全隱患越來(lái)越重視的今天，食品級(jí)微生物來(lái)源的細(xì)菌素作為生物防腐劑的應(yīng)用符合消費(fèi)者對(duì)于安全、健康和天然的要求[28]。乳酸菌細(xì)菌素具有安全、高效且無(wú)毒副作用和無(wú)抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)[29]，受到從事食品防腐劑[30]、飼料添加劑以及醫(yī)藥開(kāi)發(fā)等相關(guān)科研人員的極大關(guān)注，是目前國(guó)內(nèi)外的重要研究熱點(diǎn)之一[31-35]。Nisin是首個(gè)商業(yè)應(yīng)用的乳酸菌細(xì)菌素，具有廣譜抑菌性，但在食品工業(yè)應(yīng)用中專一性抑菌細(xì)菌素的研究開(kāi)發(fā)鮮有報(bào)道。課題組[36-37]前期從西班牙干酪中分離出一株耐久腸球菌，研究發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生一種新型細(xì)菌素Durancin GL，具有靶向抑制李斯特菌生長(zhǎng)的特性。將該細(xì)菌素應(yīng)用于食品保鮮時(shí)有望避免廣譜殺菌細(xì)菌素Nisin對(duì)食品中有益菌的抑制，在不影響食品正常菌群的前提下達(dá)到對(duì)病源李斯特菌的專一性抑制。

本研究以乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理冷鮮雞肉進(jìn)行儲(chǔ)藏試驗(yàn)，從感官評(píng)定、品質(zhì)分析以及有害微生物抑制情況考察該細(xì)菌素作為冷鮮雞肉防腐保鮮效果，為開(kāi)發(fā)新型天然安全高效食品防腐保鮮劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

E.coliRosetta (DE3) (表達(dá)菌株)：內(nèi)含本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pGEX/his-durAB質(zhì)粒，用于表達(dá)細(xì)菌素Durancin GL；

單增李斯特菌(L.monocytogenesScott A)：江蘇省疾病預(yù)防控制中心提供，本實(shí)驗(yàn)室保藏；

冷鮮雞肉：購(gòu)自南京市蘇果超市；

BHI培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基：北京路橋技術(shù)股份有限公司；

氨芐青霉素：美國(guó)Ameresco公司；

IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)：BBI生命科學(xué)公司；

寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker：天根生化科技有限公司；

HisTrap HP、GSTrap 4B親和色譜柱：美國(guó)GE公司；

腸激酶：≥ 5.0 U/μL，上海生物工程科技有限公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

全自動(dòng)凝膠成像分析儀：GelDoc XR+型，美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；

純水機(jī)：Milli-Q型，美國(guó)密理博公司；

落地式高速冷凍離心機(jī)：J-26XP型，美國(guó)Beckman Coulter公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：U-3900型，日本Hitachi公司；

恒溫振蕩器：THZ-D型，江蘇太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

生物安全柜：1300-A2型，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；

pH計(jì)：PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：SpectraMax M2e型，美國(guó)Molecular Devices公司；

蛋白純化系統(tǒng)：AKTA型，美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 Durancin GL的制備 參照文獻(xiàn)[38]制備細(xì)菌素。按照文獻(xiàn)[39]的方法測(cè)定制備的細(xì)菌素效價(jià)，并配置0(不含細(xì)菌素，用作對(duì)照)，50，100，200，400 AU/mL的保鮮液備用。

1.2.2 單增李斯特菌菌懸液制備 參考文獻(xiàn)[40]方法，培養(yǎng)并制備1.02 × 103CFU/mL單增李斯特菌菌懸液備用。

1.2.3 冷鮮雞肉處理及儲(chǔ)藏試驗(yàn) 將冷鮮雞肉分割為塊狀，每塊40 g左右。置于超凈工作臺(tái)紫外燈下滅菌處理1 h后浸潤(rùn)于1.2.2中配置的單增李斯特菌菌懸液中保持1 min，取出晾干2 h后，再浸潤(rùn)于1.2.1中制備的Durancin GL保鮮液中保持1 min，取出瀝干后裝入無(wú)菌密封袋中。以上操作均在生物安全柜中進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置兩組對(duì)照：① 未侵染單增李斯特菌組；② 侵染單增李斯特菌 + 0 AU/mL保鮮液處理組。將上述裝入無(wú)菌密封袋中樣品全部轉(zhuǎn)移至4 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行儲(chǔ)藏試驗(yàn)，每隔一段時(shí)間取樣檢測(cè)，直至樣品判定為變質(zhì)肉，終止試驗(yàn)。

1.2.4 感官評(píng)定 參照文獻(xiàn)[41]。

1.2.5 pH測(cè)定 稱取2 g樣品置于準(zhǔn)備好的研缽中，加入18 mL去離子水，進(jìn)行充分研磨后，用pH計(jì)測(cè)量漿液的pH值。

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定 按GB/T 5009.44—2016中半微量定氮法執(zhí)行。

1.2.7 單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線 取1.2.3中儲(chǔ)藏試驗(yàn)的樣品，加入5 mL滅菌生理鹽水洗滌樣品，制備單增李斯特菌菌懸液，按照通用平板計(jì)數(shù)法對(duì)冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期單增李斯特菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 本研究試驗(yàn)均設(shè)置3平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用IBM SPSS v19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 Durancin GL的制備

本實(shí)驗(yàn)室基于大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-6p-1，成功構(gòu)建出融合GST和His的雙標(biāo)簽融合Durancin GL表達(dá)載體pGEX/his-durAB，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)表達(dá)菌體進(jìn)行超聲破碎處理后，利用HisTrap HP、GSTrap 4B親和色譜柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行分離純化，用腸激酶酶切處理后得到游離的Durancin GL。利用雙標(biāo)簽純化確保獲得高純度細(xì)菌素。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，制備的細(xì)菌素HPLC、MS以及SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果均表明獲得了高純度細(xì)菌素Durancin GL。圖1(d)顯示，制備的細(xì)菌素Durancin GL對(duì)指示菌單增李斯特菌和無(wú)害李斯特菌均有顯著的抑菌效果，形成的抑菌圈清晰可見(jiàn)。制備的細(xì)菌素Durancin GL檢測(cè)結(jié)果與Ju等[38]報(bào)道一致。

圖1 細(xì)菌素Durancin GL分離純化以及抑菌活性

2.2 冷鮮雞肉儲(chǔ)藏試驗(yàn)

2.2.1 感官評(píng)定 雞肉屬于典型的白肉，與紅肉(如豬肉、牛肉等)相比，其蛋白質(zhì)含量更高，而且雞肉的肌纖維相對(duì)更加纖細(xì)，有利于微生物生長(zhǎng)繁殖[42-44]。如圖2所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，冷鮮雞肉各感官指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。儲(chǔ)藏至16 d [圖2(d)]時(shí)，細(xì)菌素含量200 AU/mL 和400 AU/mL保鮮液處理組，冷鮮雞肉仍具有較高評(píng)分，可見(jiàn)細(xì)菌素含量200 AU/mL和400 AU/mL保鮮液處理組可以顯著地延緩冷鮮雞肉的品質(zhì)劣變，而儲(chǔ)藏8 d [見(jiàn)圖2(c)]時(shí)，細(xì)菌素含量低于100 AU/mL保鮮液處理組,冷鮮雞肉已經(jīng)劣變嚴(yán)重，說(shuō)明低濃度細(xì)菌素保鮮液對(duì)冷鮮雞肉的品質(zhì)劣變延緩作用有限。

2.2.2 pH 圖3為冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期內(nèi)pH變化規(guī)律，冷鮮雞肉初始pH值為6.12，樣品較為新鮮。在16 d的儲(chǔ)藏期內(nèi)，各處理組樣品pH均呈現(xiàn)先下降然后持續(xù)上升的規(guī)律性，原因是生雞屠宰后，其體內(nèi)肌糖原會(huì)經(jīng)無(wú)氧酵解形成酸性物質(zhì)——乳酸，引起雞肉pH下降，隨后，在微生物以及內(nèi)源酶的分解作用下，蛋白質(zhì)分解出堿性物質(zhì)，如胺類等，為此，雞肉pH呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。高濃度細(xì)菌素保鮮液處理組，pH上升較慢，單增李斯特菌生長(zhǎng)繁殖受細(xì)菌素抑制對(duì)肉中蛋白質(zhì)、脂肪等分解作用相對(duì)減弱。

2.2.3 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量 圖4為冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期內(nèi)TVB-N含量變化規(guī)律，在儲(chǔ)藏6 d時(shí)，0 AU/mL和50 AU/mL細(xì)菌素保鮮液處理組樣品TVB-N含量已超過(guò)GB 16869—2005規(guī)定(低于15 mg/100 g)。《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部食品檢查方法理化部分》的劃分標(biāo)準(zhǔn)將肉分為3個(gè)等級(jí)，即：一級(jí)鮮肉(TVB-N含量≤15 mg/100 g)，二級(jí)鮮肉(15 mg/100 g20 mg/100 g)。儲(chǔ)藏至12 d時(shí)，細(xì)菌素濃度超過(guò)100 AU/mL的處理組樣品仍屬于二級(jí)鮮肉，可見(jiàn)細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌抑制，一方面減少了該食源性病原菌的增長(zhǎng)，另一方面也間接減緩冷鮮雞肉的變質(zhì)進(jìn)程。細(xì)菌素200 AU/mL和400 AU/mL保鮮液處理組的冷鮮雞肉儲(chǔ)藏2周時(shí)，仍可保持二級(jí)鮮肉的品質(zhì)。0 AU/mL保鮮液處理組樣品在儲(chǔ)藏至第10天時(shí)，TVB-N含量已經(jīng)超過(guò)25 mg/100 g，屬于變質(zhì)肉，失去繼續(xù)儲(chǔ)藏價(jià)值。

圖4 冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期內(nèi)TVB-N含量

2.2.4 單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線 按照菌落總數(shù)對(duì)肉品新鮮度進(jìn)行分類的標(biāo)準(zhǔn)，可分為一級(jí)鮮肉(菌落總數(shù)不超過(guò)106CFU/g)，二級(jí)鮮肉(菌落總數(shù)介于106～ 108CFU/g)和腐敗肉(菌落總數(shù)超過(guò)108CFU/g)[6]。一般來(lái)說(shuō)，將菌落總數(shù)106CFU/g作為區(qū)分肉品新鮮與否的分界線[45]。圖5為根據(jù)單增李斯特菌計(jì)數(shù)繪制的冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期內(nèi)單增李斯特菌的生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)結(jié)果顯示：冷鮮雞肉樣品儲(chǔ)藏10 d時(shí)，0 AU/mL和50 AU/mL保鮮液處理組中單增李斯特菌計(jì)數(shù)已經(jīng)到達(dá)106CFU/mL，可見(jiàn)，即使低溫條件下，單增李斯特菌的生長(zhǎng)繁殖依然發(fā)生，少量的細(xì)菌素不足以抑制其對(duì)肉品的破壞。

圖5 冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線

3 結(jié)論

本研究采用對(duì)李斯特菌具有專一抑制作用的乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理冷鮮雞肉進(jìn)行儲(chǔ)藏試驗(yàn)，評(píng)估該乳酸菌細(xì)菌素對(duì)冷鮮雞肉中單增李斯特菌的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn)，Durancin GL可有效控制冷鮮雞肉中單增李斯特菌菌落總數(shù)和TVB-N含量，有效延長(zhǎng)冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期。綜合試驗(yàn)結(jié)果和成本控制，200 AU/mL的細(xì)菌素保鮮液可應(yīng)用于冷鮮肉加工儲(chǔ)藏，有望解決目前冷鮮肉加工儲(chǔ)藏中李斯特菌難以控制的問(wèn)題，但是乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL在肉品保藏中的抑菌機(jī)理以及在食品工業(yè)中的應(yīng)用仍需深入研究與探索。