高效液相色譜法檢測ATP、ADP、AMP分離方法的優(yōu)化

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069)

1 前言

5-三磷酸腺苷( adenosine5 -triphosphate，ATP) 是肌肉收縮的唯一直接能量來源[1]，是生物體組織維持正常生命活動所必需的能量物質(zhì)，三磷酸腺苷二鈉(ATP-2Na)為輔酶類藥，在臨床上用于治療進行性肌萎縮、腦溢血后遺癥、心功能不全、心肌疾患及肝炎等病癥。二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)是ATP的降解產(chǎn)物，也是引起疲勞的重要因素之一[2],因此ATP、ADP、AMP與生命活動息息相關(guān)。目前，國內(nèi)檢測ATP、ADP、 AMP的方法較多，HPLC-MS/MS法[3]、離子對反相色譜法[4-7]和高效液相色譜法[1，2,8-13]。中華人民共和國藥典[4]給予了標準檢測方法，但由于方法中應(yīng)用的離子對試劑，對色譜柱有一定的損害，使色譜柱的使用壽命降低。參考文獻[1，2,8-13]的方法由于使用的色譜柱不同等諸多因素，方法往往較難重現(xiàn)，本研究根據(jù)文獻[9]的方法進行了優(yōu)化。

2 試驗部分

2.1 儀器與試劑

三磷酸腺苷二鈉(ATP)、二磷酸腺苷二鈉(ADP)、一磷酸腺苷二鈉(AMP)均為送檢者提供。磷酸二氫鈉AR，純度≥99.0%(北京化工廠)；磷酸氫二鈉AR，純度≥99%(shanghai Macxlin Biochemical Co ltd，中國)；甲醇為色譜純(Fisher，美國)。

Waters2695-2489 液相色譜(waters公司，美國，waters2695包含四元泵系統(tǒng) ；自動進樣器；在線脫氣機；柱溫箱。2489是雙波長紫外檢測器，波長范圍190～800nm)；色譜柱：Atlantis T3( 4.6*150mm 5μ，waters公司美國)，symmetryshield RP18 (4.6*250mm 5μ，waters公司，美國)。

2.2 試驗方法

2.2.1色譜條件

流動相：A：0.05mol/L磷酸緩沖鹽，pH5.85，B:甲醇；檢測波長254nm；流速1.0mL/min；進樣量10μL；柱溫：室溫。

梯度洗脫程序見表1。

表1 泵梯度洗脫程序表

2.2.2樣品的配置

樣品：由送檢者提供。

加標樣品的配制：取20μL樣品加入標準品20μL，混合均勻，作為加標樣品。

未加標樣品的配制：取樣品20μL加入水20μL，混合均勻，作為未加標樣品。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

色譜柱是液相色譜分離中的核心部件，正確選擇色譜柱，是實驗成功的關(guān)鍵?；诒緦嶒炇业臈l件和ATP的極性，結(jié)合參考文獻[9]的實驗方法和色譜柱的選擇，首先考慮用于分離極性物質(zhì)的AtlantisT3(4.6*150mm 5μ)柱和表面鍵合極性基團的symmetryshield RP18(4.6*250mm 5μ)的色譜柱，這兩款色譜柱均可用100%水相。通過樣品加標和樣品不加標及標準品色譜圖對比尋找目標化合物，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同色譜柱在0.03mol/L磷酸緩沖鹽時，樣品加標與未加標及標準品色譜圖a. T3色譜柱在緩沖鹽0.03mol/L樣品未加標的色譜圖;b . T3色譜柱在緩沖鹽0.03mol/L樣品加標后的色譜圖;c.symmetryshieldRP18色譜柱緩沖鹽在0.03mol/L樣品未加標的色譜圖;d .symmetryshield RP18色譜柱緩沖鹽在0.03mol/L樣品加標的色譜圖;e .symmetryshield RP18色譜柱緩沖鹽在0.03mol/L標準的色譜圖

通過圖1a和圖1b及圖1e比較，在AtlantisT3色譜柱中，目標化合物ATP不能確定，這可能是目標化合物隱含兩個雜質(zhì)峰之間，較難被發(fā)現(xiàn)，目標化合物ADP和AMP很容易被找到，從ADP的峰高來看，加標樣品的峰高與未加標的樣品峰增高不成比例，很可能ADP的峰存在共餾分。通過圖1c和圖1d及圖1e比較，在symmetryshield RP18這款色譜柱中，三個目標化和物ATP、ADP、AMP均比較清晰，但目標化合物ATP與前面的雜質(zhì)未分開，其分離度<1.5。由此可見symmetryshield RP18的分離效果優(yōu)于Atlantis T3柱。這可能是因為，選用的symmetryshield RP18的柱子比Atlantis T3長。柱子越長，其柱效越高，分離效果越好?；趯嶒炇业臈l件，因此選擇symmetryshield RP18這款色譜柱作為實驗用色譜柱。

3.2 緩沖鹽離子強度的優(yōu)化

圖1c和圖1d比較發(fā)現(xiàn)：緩沖鹽濃度在0.03mol/L時，ATP不能和前面的雜質(zhì)有較好的分離。把緩沖鹽的濃度增加到0.05mol/L，通過樣品加標與樣品未加標、標準品進行對比，尋找目標化合物，分離效果如圖2所示。

圖2 symmetryshield色譜柱在0.05mol/L磷酸緩沖鹽，柱溫為室溫時樣品加標與未加標的色譜圖a .0.05mol/L磷酸緩沖鹽，柱溫為室溫時樣品加標后的色譜圖;b .0.05mol/L磷酸鈉緩沖鹽、柱溫為室溫時樣品未加標的色譜圖

實驗結(jié)果表明：圖2a和圖2b所示色譜圖分離效果可以看出，0.05mol/L的緩沖鹽優(yōu)于0.03mol/L，緩沖鹽濃度在0.03mol/L時，ATP與前面的雜質(zhì)峰未完全分離，而0.05mol/L的緩沖鹽ATP與前面的雜質(zhì)完全分開，分離度為1.5477。這是因為緩沖鹽的離子強度可以抑制硅膠表面的硅醇基的活性，減小拖尾，從而改善分離。

3.3 柱溫的優(yōu)化

柱溫選30℃和室溫在緩沖鹽在0.05mol/L的濃度下，通過樣品加標和未加標樣品進行比對，結(jié)果如圖3所示。

通過圖3a和圖3b進行比對，目標化合物ATP的色譜峰不明顯，有可能隱含在保留時間4分多鐘的雜質(zhì)峰內(nèi)，目標化合物ADP也與前面的雜質(zhì)峰未分開，分離度只有0.867。圖3a和圖2a 相比，顯然室溫的分離效果更好，這可能是由于柱溫的增加，使得流動相的黏度降低，目標化合物溶解度增加，保留減弱。由于ATP的保留比較弱，增加柱溫后，保留更弱，不利于與雜質(zhì)峰的分離。因此室溫更適合ATP、ADP、AMP的分離。

圖3 symmetryshield色譜柱在0.05mol/L磷酸緩沖鹽，柱溫在30℃樣品加標與未加標的色譜圖a.10.05mol/L磷酸緩沖鹽，柱溫在30℃樣品加標的色譜圖;b .0.05mol/L磷酸緩沖鹽，柱溫在30℃樣品未加標的色譜圖

4 結(jié)論

通過比較兩種色譜柱的分離效果，確定色譜柱后，再通過改變緩沖鹽的濃度，和柱溫的比較優(yōu)化ATP、ADP、AMP的分離條件，最后確定實驗條件為使用symmetryshield RP18 (4.6*250mm 5μ)色譜柱，磷酸緩沖鹽濃度0.05mol/L，室溫。分離度分別為1.5477、1.6459、3.855，符合中國人民共和國藥典關(guān)于分離度的要求。