組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用進(jìn)展Ⅱ：蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)

張?jiān)趯? 趙 海, 胡夢(mèng)輝, 鄧麗君, 王 琦, 李九麗, 袁紅雨,2

1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 河南 信陽 464000;2.信陽師范學(xué)院, 河南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 信陽 464000

長期以來，由于核酸分子和與之相關(guān)的測序技術(shù)的特點(diǎn)，基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)是最早成功應(yīng)用于大規(guī)模研究基因功能的組學(xué)技術(shù)。尤其是轉(zhuǎn)錄組學(xué)，因細(xì)胞或組織中mRNA的水平直接與相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，其在基因功能的研究中得到了非常廣泛的重視。然而， mRNA的表達(dá)水平并不能很好地反映蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。目前學(xué)術(shù)界比較認(rèn)同的觀點(diǎn)是某物種推定合成的蛋白質(zhì)組分別都超過了其基因組和轉(zhuǎn)錄組(mRNA)的數(shù)量，這主要是由mRNA的選擇性剪接和復(fù)雜多樣的各種翻譯后修飾所致[1]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)在植物的花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用必定會(huì)極大地補(bǔ)充轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究。作為各種生理功能的直接參與者，對(duì)花藥蛋白質(zhì)功能的大規(guī)模研究將更加深入地幫助人們揭示并理解關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能和各種復(fù)雜的與發(fā)育或代謝相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在花藥發(fā)育關(guān)鍵蛋白的研究、抗逆蛋白的篩選和蛋白的翻譯后修飾機(jī)制及功能等方面獲得了廣泛應(yīng)用。

與蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)出現(xiàn)的時(shí)間要更晚一些。但是隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，與代謝組學(xué)相關(guān)的文獻(xiàn)日益增多，這說明人們?cè)絹碓街匾曉谏锘瘜W(xué)層面大規(guī)模地探究各種生物小分子所發(fā)揮的關(guān)鍵作用?；ㄋ幇l(fā)育是一個(gè)非常精細(xì)復(fù)雜的過程，涉及環(huán)境、遺傳和生化等多個(gè)層面的內(nèi)容。各種組學(xué)技術(shù)(包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))將對(duì)系統(tǒng)而深入地理解花藥發(fā)育的調(diào)控機(jī)制、逆境脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及系統(tǒng)發(fā)育的生化規(guī)律貢獻(xiàn)更多具有突破性的知識(shí)。

鑒于當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在花藥發(fā)育方面的應(yīng)用不斷深化，相關(guān)富有價(jià)值的研究成果不斷涌現(xiàn)，本系列文章前文已介紹了轉(zhuǎn)錄組學(xué)[2]在植物花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用，本文著重綜述蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)在植物花藥和花粉發(fā)育、雄性不育和逆境脅迫中的研究成果，以及磷酸化蛋白和乙?；鞍自诨ㄋ幹械难芯窟M(jìn)展，并總結(jié)和評(píng)述了多層組學(xué)整合分析的發(fā)展趨勢(shì)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)關(guān)鍵的生物分子，對(duì)生命活動(dòng)有著十分重要的作用。與基因不同，蛋白質(zhì)在生長發(fā)育、代謝、繁殖和免疫防御等各個(gè)方面都有它獨(dú)特的作用[3]。蛋白質(zhì)組的概念最先由Marc Wilkins在1994年提出，指由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是系統(tǒng)分析存在于組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞區(qū)室的蛋白質(zhì)組[4]?；ㄋ幇l(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，依賴于蛋白質(zhì)合成和降解的調(diào)節(jié)[5]。擬南芥、水稻、玉米、煙草和番茄等植物基因組序列測序的完成為花藥的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于花藥發(fā)育和花粉產(chǎn)生的研究中[4]。花藥蛋白質(zhì)組學(xué)是植物蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要組成部分。此外，出現(xiàn)了許多細(xì)胞特異性和亞細(xì)胞花藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究，有助于理解特定蛋白質(zhì)在特定類型的細(xì)胞和亞細(xì)胞器中的作用和功能。蛋白質(zhì)組學(xué)工具的優(yōu)點(diǎn)之一是可以研究由選擇性剪接、mRNA編輯、翻譯同步修飾和翻譯后修飾所產(chǎn)生的各種蛋白質(zhì)[6]，因此被廣泛利用在各個(gè)領(lǐng)域。經(jīng)過多年的發(fā)展和改進(jìn)，目前常用的蛋白質(zhì)組分析方法有二維凝膠電泳、質(zhì)譜鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)等，利用這些技術(shù)可以對(duì)各種組織和細(xì)胞中的基因產(chǎn)物進(jìn)行全面的分析，同時(shí)也可以對(duì)某些特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量以及結(jié)構(gòu)和功能的分析[4]。表1中總結(jié)了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在不同植物花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1.1 在研究花粉發(fā)育功能蛋白方面的應(yīng)用

Kerim等[11]使用蛋白質(zhì)組學(xué)研究在正常生長水稻花藥中花粉發(fā)育過程中蛋白質(zhì)合成的變化模式，鑒定出的蛋白質(zhì)在糖代謝、細(xì)胞伸長和細(xì)胞擴(kuò)增等方面具有重要作用。另外，一些低豐度蛋白質(zhì)可能在花粉發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用。再者，一些相同蛋白質(zhì)存在多種亞型，在花粉發(fā)育過程中，這些蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生某種翻譯后修飾。這為水稻花藥蛋白質(zhì)的補(bǔ)充及其在花粉發(fā)育過程中的時(shí)空調(diào)控提供了有用的信息?；ㄋ幇l(fā)育是一個(gè)高能耗過程，花藥或花粉發(fā)育過程中涉及的主要事件是細(xì)胞減數(shù)分裂、有絲分裂和花粉壁形成，以及花粉萌發(fā)的能量儲(chǔ)存，這為花粉將雄性配子傳遞到胚囊進(jìn)行雙重受精奠定了基礎(chǔ)[23]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，與糖類和能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)可能在花粉發(fā)育中發(fā)揮作用[24]。在Columbia 和Landsberg兩種生態(tài)型的擬南芥以及番茄花粉中鑒定出大量參與能量轉(zhuǎn)換相關(guān)的蛋白質(zhì)[4,25,26]。除此之外，在這些物種的花粉中鑒定出的蛋白質(zhì)功能多樣，涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激耐受、細(xì)胞骨架形成、轉(zhuǎn)錄、代謝、防御、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成和加工、鈣離子結(jié)合等多個(gè)方面，這些存在于花粉中的蛋白質(zhì)反映了這種小的雙細(xì)胞獨(dú)立結(jié)構(gòu)的存活方式以及可能對(duì)隨后花粉萌發(fā)和花粉管生長產(chǎn)生的影響。花粉外壁是花粉粒的最外層，花粉外壁蛋白是花粉粘附和水合、花粉與柱頭識(shí)別和交流，以及花粉萌發(fā)和柱頭入侵所必需的?；ǚ弁獗诘鞍踪|(zhì)組在親緣關(guān)系相近的物種中成分幾乎一致，在不同的物種中存在很大差異，這些差異可能反映在功能上；其次，一些花粉外壁蛋白顯示出相當(dāng)多的形式，它們可能具有不同的生化功能或有助于花粉和柱頭的特異性識(shí)別。此外，許多這些蛋白質(zhì)成分能夠在人體中引起IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[27]。Kim等[12]使用鳥槍法對(duì)水稻花藥進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了3 266個(gè)非冗余蛋白質(zhì)，ATP合成酶、含有Cupin結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和花粉過敏原大量存在于水稻花藥中，這表明水稻花粉過敏原具有潛在的重要生理作用。

表1 蛋白組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用Table 1 Application of proteomics in anther development research.

1.2 在解析雄性不育分子機(jī)制方面的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)過不斷的發(fā)展已經(jīng)被廣泛用于揭示多種植物中不育花藥蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，通過分析所得數(shù)據(jù)可以很好的解釋植物不育機(jī)制[28]。近年來，對(duì)水稻、番茄、油菜、枸杞、玉米和柚子等各種雄性不育突變體中進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在這些物種中分離純化出了大量與雄性不育的產(chǎn)生有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括蛋白酶體亞基、ATP合成酶亞基、核糖核蛋白和類黃酮，這些極大地促進(jìn)了雄性不育的研究[19]。Xing等[20]在白菜中發(fā)現(xiàn)與花粉發(fā)育、生長素和脅迫有關(guān)的基因響應(yīng)和ATP合成基因的延遲表達(dá)導(dǎo)致花粉產(chǎn)生缺陷，從而導(dǎo)致雄性不育。Liu等[19]在棉花光敏雄性不育突變體中發(fā)現(xiàn)絨氈層的異常降解導(dǎo)致花粉外壁形成缺陷，活性蛋白酶體促進(jìn)功能蛋白降解，Ca2+穩(wěn)態(tài)被擾亂，阻止植物花粉成熟，最終導(dǎo)致雄性不育。

植物雄性不育與線粒體功能障礙也有一定的關(guān)系，Wang等[23]在小麥中發(fā)現(xiàn)了71種引起花粉敗育的差異表達(dá)的線粒體基因，提出并證實(shí)了小麥中線粒體介導(dǎo)的雄性不育網(wǎng)絡(luò)。在化學(xué)雜交劑(CHA)-SQ-1誘導(dǎo)的生理雄性不育小麥中發(fā)現(xiàn)了103個(gè)差異表達(dá)的基因，這些基因與糖代謝、氧化應(yīng)激和抗性、蛋白質(zhì)代謝、光合作用、細(xì)胞死亡、細(xì)胞骨架和細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)[8]。通過同位素親和標(biāo)簽(isotope-code affinity tag, ICAT)技術(shù)，在單核期水稻花藥中鑒定了97種非冗余蛋白，8種不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)表達(dá)蛋白。將ICAT數(shù)據(jù)與RT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)能量代謝可以控制紅蓮水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育，同時(shí)這些數(shù)據(jù)幫助研究者們了解導(dǎo)致紅蓮水稻花粉敗育的分子機(jī)制和生化途徑[13]。

1.3 在篩選花藥抗逆蛋白方面的應(yīng)用

水稻開花階段是對(duì)溫度最敏感的時(shí)期[16]。由于水稻適合在熱帶和亞熱帶地區(qū)生長，因此水稻具有易受低溫影響的特征，低溫易對(duì)早期小孢子發(fā)育造成損傷從而導(dǎo)致不育花粉的產(chǎn)生。在低溫處理的水稻植株的花藥中，花藥呼吸減少，蔗糖在花藥中積累，蛋白質(zhì)水平下降，氨基酸組成也發(fā)生變化，體現(xiàn)在脯氨酸的大幅減少和天冬酰胺的增加[14]。Imin等[14]在水稻花藥中鑒定出了可能參與蛋白質(zhì)合成和折疊、應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)產(chǎn)生、細(xì)胞壁形成、蛋白質(zhì)分解和能量代謝的冷敏感蛋白，并且會(huì)影響到生物過程；同時(shí)，他們已經(jīng)觀察到冷處理會(huì)影響線粒體及其內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和細(xì)胞壁以及細(xì)胞外壁的形成。在低溫處理水稻花藥發(fā)育后期鑒定的蛋白質(zhì)中觀察到7種蛋白質(zhì)作為分解或裂解產(chǎn)物，證明了低溫脅迫在小孢子發(fā)育早期增強(qiáng)并誘導(dǎo)了三核花粉中的蛋白質(zhì)的部分降解[15]?；ㄋ庨_裂易受到高溫影響，另外花粉萌發(fā)和花粉管生長對(duì)高溫也比較敏感。Jagadish等[16]在N22高耐熱型水稻中發(fā)現(xiàn)冷休克蛋白和熱休克蛋白顯著上調(diào)，熱休克蛋白作為變性蛋白質(zhì)的中間體儲(chǔ)存，可以防止由于高溫引起的蛋白質(zhì)聚集，熱休克蛋白的積累可能在保護(hù)細(xì)胞的代謝活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，這可能導(dǎo)致N22的耐熱性更強(qiáng)，而在高溫敏感型水稻中冷休克蛋白和熱休克蛋白表達(dá)水平卻明顯降低。

干旱脅迫對(duì)花藥發(fā)育的影響較為嚴(yán)重，特別是出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的傷害。在玉米中，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致開花和吐絲不同步，并抑制花藥開裂。Liu 和Bennett[6]對(duì)Moroberekan和IR64兩種基因型的水稻進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)的不育不僅由糖代謝紊亂造成，也由花藥花粉發(fā)育和細(xì)胞功能紊亂造成。Sarhadi通過比較了鹽脅迫下鹽敏感型和耐鹽型兩種不同水稻基因型的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)糖類代謝和能量代謝、花藥代謝和花粉壁重塑代謝可能參與水稻在生殖階段的鹽脅迫響應(yīng)[17]。

1.4 在研究花藥蛋白磷酸化修飾方面的應(yīng)用

蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTP的γ位磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的過程。真核生物中，約有三分之一的蛋白質(zhì)具有磷酸化修飾，體現(xiàn)了磷酸化修飾的普遍性和重要性。生物體內(nèi)能被磷酸化修飾的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成了這一生物的磷酸化蛋白質(zhì)組。采用蛋白質(zhì)組學(xué)的分析方法，研究細(xì)胞中所有磷酸化蛋白質(zhì)及其修飾過程，從整體上觀察細(xì)胞中被修飾的磷酸化蛋白質(zhì)的狀態(tài)及其變化，進(jìn)而分析特定磷酸化修飾對(duì)生命過程的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，構(gòu)成了研究磷酸化蛋白質(zhì)的全新內(nèi)容，由此派生出磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)這一新領(lǐng)域。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，形成了一系列對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行富集分離、定性定量和功能分析的新方法，目前對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的分離富集技術(shù)主要有32P放射性標(biāo)記法、特異抗體的免疫共沉淀法、熒光染料染色和色譜分離法等技術(shù)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以在單個(gè)項(xiàng)目中識(shí)別超過2萬個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在真核生物中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是最常見的磷酸化位點(diǎn)。系統(tǒng)地鑒定生殖組織中的磷酸化蛋白質(zhì)和相關(guān)過程對(duì)探索花藥發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常有用，并且可以發(fā)現(xiàn)花藥發(fā)育的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[18]。

Ye等[9]在擬南芥花藥發(fā)育4-7期和8-12期的研究進(jìn)一步表明，酪蛋白激酶II、絲裂原活化蛋白激酶和14-3-3蛋白的磷酸化是花藥發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制，擬南芥磷酸化蛋白的功能與水稻磷酸化蛋白質(zhì)組功能相似。此外，他們發(fā)現(xiàn)磷酸化可能會(huì)降低活性氧清除酶的活性，并阻礙早期花藥發(fā)育過程中的油菜素類固醇信號(hào)傳導(dǎo)，表明其活性可能通過磷酸化而被開啟(表1)。

1.4.1在解析減數(shù)分裂時(shí)蛋白磷酸化作用方面的應(yīng)用 在減數(shù)分裂時(shí)，花藥發(fā)育是開花植物的關(guān)鍵階段，蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要的翻譯后修飾，可以調(diào)節(jié)水稻中的減數(shù)分裂過程，其通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和蛋白質(zhì)相互作用，在控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起著至關(guān)重要的作用[18]。使用水稻雌蕊組織、水稻花藥和擬南芥花藥進(jìn)行了三次大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析[9,18,29]，確定了水稻和擬南芥花藥中的大量蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)，具有8 973個(gè)磷酸化位點(diǎn)的3 203個(gè)磷酸化蛋白在減數(shù)分裂時(shí)期的水稻花藥中被鑒定，鑒定的磷酸化蛋白的主要功能包括DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)；減數(shù)分裂蛋白在內(nèi)的許多蛋白在多個(gè)位點(diǎn)磷酸化，顯示不同的調(diào)控趨勢(shì)[4]。Ye等[18]對(duì)水稻減數(shù)分裂時(shí)期蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)磷酸化蛋白中的DNA修復(fù)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白比較多，163個(gè)推定的分泌蛋白也是磷酸化的，可能在細(xì)胞間的通訊中起作用。此外，他們發(fā)現(xiàn)DNA合成、RNA剪接和RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑受到磷酸化的廣泛影響。

1.4.2在解析轉(zhuǎn)錄因子磷酸化作用方面的應(yīng)用

磷酸化影響真核生物中總蛋白質(zhì)的約三分之一，并受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的動(dòng)態(tài)平衡作用的調(diào)節(jié)[18]。蛋白激酶和磷酸酶的可逆蛋白磷酸化調(diào)節(jié)是真核生物中最廣泛和最重要的翻譯后修飾之一，其通常通過轉(zhuǎn)錄因子(TF)磷酸化或去磷酸化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄因子的活性通常受翻譯后修飾的影響，可協(xié)調(diào)各種細(xì)胞過程[9]。在擬南芥中，MAPK3/MAPK6對(duì)WRKYTF TF(WRKY33)的磷酸化是花粉發(fā)育和功能所必需的[30]。堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子FD通過鈣依賴性蛋白激酶的磷酸化對(duì)于其與成纖維素轉(zhuǎn)錄因子的相互作用是至關(guān)重要的[31]。此外，BIN2對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子BES1/BZR2的磷酸化可能妨礙BES1/BZR2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低了花藥和花粉發(fā)育中涉及的下游關(guān)鍵基因的表達(dá)[32, 33]。據(jù)報(bào)道，EMS1在早期花藥發(fā)育過程中起磷酸化形式的作用，盡管磷酸化位點(diǎn)仍未知[33]。

1.4.3在解析花粉蛋白磷酸化作用方面的應(yīng)用

已有研究用擬南芥成熟花粉為材料進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在成熟花粉鑒定到598個(gè)磷酸化蛋白，這些蛋白在調(diào)節(jié)代謝、蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中起著關(guān)鍵作用。除此之外，還鑒定出了包括Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶和受體樣激酶的許多激酶，這表明花粉表達(dá)的激酶的磷酸化在花粉發(fā)育中起重要作用[10]。對(duì)煙草成熟花粉和花粉管進(jìn)行的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出439種磷酸化蛋白，其中大多數(shù)蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)儲(chǔ)存以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[21,22]。

1.5 在解析花藥蛋白乙?；揎椃矫娴膽?yīng)用

蛋白質(zhì)乙?；堑鞍追g后修飾的一種，包括組蛋白和非組蛋白的乙?；揎?，是一種普遍存在的、動(dòng)態(tài)的、可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。它參與了包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)通路調(diào)控、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控、細(xì)胞代謝等多個(gè)生理過程[34]。對(duì)于乙酰化的研究方式則主要有質(zhì)譜鑒定、特異性乙?；贵w鑒定、標(biāo)記底物為基礎(chǔ)的方法等。這些技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)乙?；揎椀陌l(fā)現(xiàn)以及乙?；揎椩谏?xiàng)l件下所發(fā)揮的功能的相關(guān)研究起到至關(guān)重要的作用。

蛋白賴氨酸乙?；且环N在真核生物和原核生物中發(fā)現(xiàn)的可逆的和動(dòng)態(tài)的翻譯后修飾[35]。盡管蛋白質(zhì)賴氨酸乙?；畛跏窃诮M蛋白修飾中被鑒定出來的，但是后來它被發(fā)現(xiàn)存在于大量的蛋白質(zhì)中并且參與多個(gè)細(xì)胞過程[36,37]，例如染色質(zhì)重塑和細(xì)胞周期[36]、DNA雙鏈斷裂形成[38]、細(xì)胞代謝[39]和微管的穩(wěn)定性[40]。蛋白質(zhì)賴氨酸乙?；绊懡湍负蛣?dòng)物的生殖發(fā)育和減數(shù)分裂，但在開花植物的生殖發(fā)育過程中研究的卻比較少，特別是在某個(gè)生殖階段中[41]。Li等[42]對(duì)發(fā)現(xiàn)的賴氨酸乙?；鞍踪|(zhì)進(jìn)行了Gene Ontology(GO)分析，發(fā)現(xiàn)賴氨酸乙?；赡苡绊懢€粒體蛋白功能，從而影響植物的減數(shù)分裂和花藥發(fā)育。進(jìn)一步對(duì)賴氨酸乙酰化蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析，發(fā)現(xiàn)蛋白賴氨酸乙酰化影響花藥發(fā)育的不同過程。此外，他們發(fā)現(xiàn)與孢粉素生物合成過程有關(guān)的蛋白質(zhì)和與脂肪酸生物合成過程相關(guān)的蛋白質(zhì)也被乙?；?，這兩個(gè)過程已被證明對(duì)花粉發(fā)育很重要，從而推測蛋白賴氨酸乙?；诨ǚ郯l(fā)育中起著重要的作用[41]。

2 代謝組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是Nicholson等[43]在1999年提出的概念，即對(duì)某一生物組分或細(xì)胞在某一特定生理時(shí)期或條件下所有代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量的分析，以發(fā)現(xiàn)差異代謝物，進(jìn)而明確某一時(shí)刻生物組分或細(xì)胞的完整生理狀態(tài)。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后又一門新興的組學(xué)技術(shù)，是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要分支。代謝組學(xué)研究可以更好地解析植物雄性不育形成和逆境脅迫下的生化機(jī)制，作為組學(xué)技術(shù)中一門新興的和不斷發(fā)展的學(xué)科，已經(jīng)成為揭示生物體系變化規(guī)律的重要手段，在很多個(gè)方面得到廣泛運(yùn)用。代謝組分析技術(shù)包括代謝物的分離、檢測及鑒定。目前，代謝產(chǎn)物的分離技術(shù)主要有氣相色譜、液相色譜和毛細(xì)管電泳等。檢測及鑒定技術(shù)主要有質(zhì)譜、核磁共振、庫侖分析、傅立葉變換紅外光譜、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測和光散射等(表2)。在實(shí)際操作中一般采用多種分離、檢測方法并用，以盡可能多地獲取代謝物組分。

Yue等[45]利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析矮牽?；ㄋ幇l(fā)育的代謝變化，通過偏最小二乘法判別分析發(fā)現(xiàn)，參與淀粉和蔗糖代謝的果糖和葡萄糖為最重要的代謝物，說明糖信號(hào)通路可能在花藥發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，之前的一項(xiàng)研究已經(jīng)證明糖信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能是棉花花藥的中心信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，并且在高溫條件下可以抑制蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖。此外，他們對(duì)光合相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示其隨著花藥發(fā)育而降低的表達(dá)趨勢(shì)，說明隨著花藥的發(fā)育，能量和糖類代謝途徑的活動(dòng)逐漸減少[46]。Tang等[44]使用細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和非靶向代謝組學(xué)來研究小麥花藥發(fā)育階段中存在的多糖、脂類和所有代謝物的分布特征，發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)和糖酵解在花藥發(fā)育期間非常活躍，用以提供花藥和花粉發(fā)育所需的能量。

茉莉酸酯是植物應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育所需的信號(hào)組分，茉莉酮酸生物合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻會(huì)導(dǎo)致植物育性喪失。對(duì)番茄野生型和茉莉酸不敏感1-1(jai1-1)突變體進(jìn)行花藥激素含量、轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)，野生型番茄花藥表現(xiàn)出茉莉酮酸的短暫增加，而在jai1-1突變體中卻沒有茉莉酮酸的短暫增加。在早期花藥發(fā)育中，茉莉酮酸酯促進(jìn)與花粉營養(yǎng)和水供應(yīng)相關(guān)的過程。在后期發(fā)育階段，jai1-1突變體中的茉莉酸不敏感性導(dǎo)致乙烯信號(hào)傳導(dǎo)中的調(diào)節(jié)因子過早表達(dá)，這使乙烯過早合成，從而導(dǎo)致花藥過早開裂[47]。在擬南芥茉莉酸缺乏或不敏感突變體中，花藥的開裂被推遲，這與茉莉酸番茄的影響相反。在野生型擬南芥成熟花中，茉莉酸水平最高[49]，并且在花藥發(fā)育的第12期，雄蕊需要茉莉酸的積累以促使花絲伸長[50]，這說明茉莉酸可能作為一種正向調(diào)節(jié)劑，通過觸發(fā)擬南芥花藥發(fā)育開關(guān)，影響花藥成熟和開裂。另外，通過對(duì)桐樹花朵細(xì)胞學(xué)觀察、內(nèi)源性植物激素測定和RNA-seq綜合分析發(fā)現(xiàn)，在雌花發(fā)育中期，水楊酸積累引發(fā)細(xì)胞程序性死亡，并阻止花藥和花粉發(fā)育，最終導(dǎo)致桐樹雌花中的雄蕊敗育[47]。

表2 代謝組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用Table 2 Application of metabonomics in anther development research.

3 展望

在生物系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)通過與代謝物、各種RNA和其他類型蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜相互作用發(fā)揮其特定的作用。蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的整合將成為未來應(yīng)用的一個(gè)非常有前途的研究領(lǐng)域，可以為闡明分子機(jī)制提供一種方式。對(duì)植物花藥發(fā)育的蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組研究的比較多，特別是在擬南芥和水稻中，代謝組的研究比較少，得到的數(shù)據(jù)不如蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組多。因此，未來需要進(jìn)一步詳細(xì)研究每個(gè)組學(xué)內(nèi)容，更加積極研究之前沒有涉及到的領(lǐng)域，同時(shí)結(jié)合每個(gè)組學(xué)的數(shù)據(jù)對(duì)從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平的生物過程進(jìn)行全面深入的闡釋。這將提供更大的機(jī)會(huì)來研究花藥發(fā)育中基因之間的相互作用、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)和代謝物之間的相互作用。此外，需要更多關(guān)注分離花藥特定的細(xì)胞類型，改進(jìn)蛋白質(zhì)、RNA以及各種代謝產(chǎn)物提取和鑒定方法，進(jìn)行技術(shù)上的不斷革新，數(shù)據(jù)的不斷挖掘，從而推動(dòng)組學(xué)技術(shù)在植物育種以及其他方面的應(yīng)用。