蘋果園不同間作模式對(duì)土壤理化性質(zhì)及微生物群落的PLFA分析

李旭銳，張 燕，張 杰，姚允聰

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

蘋果樹作為中國(guó)栽培面積最大的經(jīng)濟(jì)果樹，是人們生活中必不可缺的水果，但是由于人們不合理的種植方式，導(dǎo)致果園土壤越來越貧瘠，而化肥的增施使情況更加惡化，因此合理進(jìn)行果樹栽培與種植是生態(tài)果園的重要目標(biāo)。在現(xiàn)代果園和人工造林景觀中，復(fù)合生態(tài)模型越來越受到人們的重視，如多年生木本植物多用作主要樹種，一年生和二年生草本景觀植物、經(jīng)濟(jì)上有價(jià)值的牧草和開花地被植物為間作植物，如苜蓿即可作為綠肥植物，也可用作開花植物以及景觀植物。前人研究表明，合理的間作措施能夠利用植物不同的生長(zhǎng)習(xí)性和生理特征，利用其生態(tài)位互補(bǔ)的原理，使得自然資源的利用效率最大限度提高，生態(tài)系統(tǒng)物種多樣性得以進(jìn)一步豐富，使果園形成一個(gè)小型生態(tài)圈。

間作能夠有效提高光能[1]和水分[2]利用率減少土壤水分蒸發(fā)，同時(shí)可提高土地利用效率，提高抑制病蟲害發(fā)生的幾率。例如，橡膠林中間作豆科植物可以提高土壤有機(jī)碳和總氮量、土壤微生物活性，以及潛在的有效氮含量[3]。Kremer和Kussman報(bào)道在山核桃果園的小路上與庫拉三葉草間作可以增加土壤酶的活性和土壤有機(jī)碳的含量，改善土壤結(jié)構(gòu)，減少土壤侵蝕[4]。María等[5]研究表明，在杏樹(PrunusdulcisL.)果園間作可以通過提高土壤有機(jī)碳、土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性和微生物活性來改善土壤質(zhì)量。這些植物物種通過調(diào)節(jié)微生物群落對(duì)土壤碳積累的影響一直受到關(guān)注。合理間作是現(xiàn)代化農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)的一項(xiàng)重要措施。

芳香植物可兼具藥用和芳香特性，因此被認(rèn)為是廉價(jià)保健產(chǎn)品的來源，對(duì)草食性害蟲具有殺蟲、拒食和驅(qū)避作用，從而為農(nóng)民提供收入來源。一些研究表明，與某些芳香植物間作可以改善土壤條件。例如，羅勒(OcimumbasilicumL.)和香薄荷(SaturejahortensisL.)間作已被證實(shí)能顯著增加土壤有機(jī)氮和有效氮[6]。羅勒是一年生唇形科植物，具有很高的藥用價(jià)值，前人研究發(fā)現(xiàn)其汁液提取物具有廣泛的抗病毒性[7]，Jeyasankar等[8]研究表明羅勒揮發(fā)的芳香性氣體具有趨避害蟲的作用，然而羅勒對(duì)土壤養(yǎng)分和微生物群落影響的研究還知之甚少。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和最具影響力的組分之一，土壤中的微生物對(duì)凋落物以及動(dòng)植物殘?bào)w的分解，是土壤有機(jī)質(zhì)以及其他養(yǎng)分的主要來源，微生物的活性是土壤肥沃程度的重要指標(biāo)，因此對(duì)土壤微生物的豐度以及多樣性的研究也是當(dāng)今科學(xué)家的研究熱點(diǎn)，同時(shí)對(duì)土壤養(yǎng)分的提高有著至關(guān)重要的作用。

本研究旨在果園間作系統(tǒng)下，在果樹的不同生長(zhǎng)時(shí)期，探究羅勒對(duì)蘋果園小生態(tài)系統(tǒng)的改善機(jī)制，進(jìn)一步與傳統(tǒng)的自然生草進(jìn)行比較，探究其優(yōu)劣。結(jié)合磷脂脂肪酸生物標(biāo)記技術(shù)，通過對(duì)土壤中微生物細(xì)胞膜磷脂脂肪酸含量的鑒定，研究在不同間作系統(tǒng)下土壤微生物群落分布狀況以及與土壤養(yǎng)分狀況的變化關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間為2016年5月和2016年8月，試驗(yàn)地位于北京市昌平區(qū)流村鎮(zhèn)王家園有機(jī)蘋果園內(nèi)。試驗(yàn)地處于北京市昌平區(qū)(東經(jīng)116.33°，北緯39.73°)，該地區(qū)氣候四季分明，屬于溫帶半濕潤(rùn)大陸季風(fēng)性氣候。月平均最高氣溫25.89 ℃，最低氣溫-4 ℃。年降水量分布不勻，夏季7月和8月集中降水，其余時(shí)間降水較少。土壤為輕沙質(zhì)土類型。試驗(yàn)地面積35 000 m2，主要栽植品種為‘富士’(Malusdomesticacv. ‘Fuji’/Malusprunifolia)，樹齡為15年，株行距為5 m×6 m，樹木長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良，2007年獲得有機(jī)果園稱號(hào)。全園禁用農(nóng)藥化肥，采用人工和物理結(jié)合防治的管理方法。全園的土壤、環(huán)境、地勢(shì)基本相同，管理方式基本一致。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

設(shè)置3個(gè)處理：清耕(CK)、自然生草(Tr1)、羅勒(Tr2)。羅勒于2016年4月6日開始播種，于蘋果樹行間(距離樹干1 m)處進(jìn)行種植，自然生草和羅勒處理區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，間作植物覆蓋率90%，3次重復(fù)。分別于2016年5月23日幼果期和2016年8月23日果實(shí)膨大期采集土樣。取樣時(shí)去除表層雜物，用管型土鉆采集。每個(gè)小區(qū)按照S型五點(diǎn)取樣法取樣[9]，取0～20 cm表層土層的新鮮土樣。采集的土壤過1 mm篩，混勻后分成2份裝入自封袋中，一份用于含水量、pH值以及磷脂脂肪酸的測(cè)定，另一份經(jīng)通風(fēng)處晾干用于有機(jī)質(zhì)以及各種營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤理化指標(biāo)測(cè)定 土壤酸堿度(pH)、土壤含水量(SWC)參照常規(guī)方法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)用重鉻酸鉀-油浴加熱法測(cè)定；全氮(TN)含量用半微量凱氏法測(cè)定；有效磷(AP)、有效鉀(AK)采用M3浸提法測(cè)定[10]。

1.3.2 土壤微生物生物量的測(cè)定 土壤微生物生物量的測(cè)定采用磷脂脂肪酸法，土壤脂肪酸的提取和檢測(cè)主要分為四步：提取、分離、酯化、GC-MS分析[11-12]。首先稱取10 g新鮮土樣，加入KOH甲醇溶液使脂肪酸釋放并甲酯化，用醋酸溶液中和pH再加10 mL正己烷，使FAMEs全部轉(zhuǎn)到正己烷相中后，去除水相，收集有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈桑瑢⑻崛〉腇AMEs溶解于0.5 mL(V正己烷∶V甲基叔丁基醚=1∶1)中，充分溶解后轉(zhuǎn)入GC小瓶，同時(shí)加入5 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯(19∶0)，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定得到各脂肪酸含量。采用SherlockMIS4.5和MIDI軟件鑒定分析并估算微生物生物量及菌群結(jié)構(gòu)，脂肪酸采用Frostegrd方法命名[13]，PLFA標(biāo)記名稱參考表1。

表1 不同微生物種群的磷脂脂肪酸標(biāo)記Tab.1 PLFA of different microbial communities

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Spss24.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和皮爾森(Pearson)相關(guān)性分析檢驗(yàn)土壤理化指標(biāo)與微生物之間的差異；采用Canoco5軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)和冗余分析(redundancy analysis, RDA)，差異顯著為P<0.05，差異極顯著為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 果園間作對(duì)土壤理化特性的影響

果園間作對(duì)土壤理化特性的影響見表2。在幼果期，土壤pH的變化趨勢(shì)為：清耕，自然生草>羅勒；含水量、有機(jī)質(zhì)和全氮的大小順序?yàn)椋鹤匀簧?，羅勒>清耕；碳氮比的大小順序?yàn)椋鹤匀簧?羅勒>清耕；速效鉀和速效磷的大小順序?yàn)椋毫_勒>自然生草>清耕。在果實(shí)膨大期，土壤pH明顯低于幼果期，大小順序?yàn)椋呵甯?自然生草>羅勒；土壤含水量、土壤有機(jī)質(zhì)、碳氮比、速效鉀和速效磷含量的變化趨勢(shì)為：羅勒>自然生草>清耕。土壤養(yǎng)分含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，此外，果樹間作處理下的土壤養(yǎng)分含量顯著高于清耕。

表2 果園間作對(duì)土壤理化特性的影響Tab.2 Effects of intercropping system on soil physicochemical properties

注:數(shù)值后不同字母表示處理之間差異達(dá)P<0.05顯著水平。

Note： Values followed by different letters are significant atP<0.05 level among treatments.

2.2 不同間作系統(tǒng)中微生物生物量的變化

通過磷脂脂肪酸生物標(biāo)記技術(shù)對(duì)土壤中微生物群落的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)的不同生長(zhǎng)時(shí)期，土壤中微生物生物量不相同。在幼果期也就是芳香植物幼苗期，果樹行間自然生草的微生物總生物量、細(xì)菌、真菌及叢枝菌根真菌生物量高于清耕和羅勒，有顯著差異(P<0.05)；果實(shí)膨大期，羅勒表現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，除細(xì)菌/真菌以外，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于自然生草和清耕(圖1)。

2.3 土壤微生物生物量與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

在果實(shí)的不同生長(zhǎng)時(shí)期，土壤微生物群落與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析表明，在幼果期土壤微生物群落與土壤含水量和土壤有機(jī)質(zhì)含量有很強(qiáng)的相關(guān)性，土壤含水量顯著影響土壤叢枝菌根真菌和微生物總生物量，羅勒的土壤中細(xì)菌與真菌的豐度與土壤有機(jī)質(zhì)顯著相關(guān)(P<0.01)；果實(shí)膨大期，土壤有機(jī)質(zhì)顯著影響自然生草和羅勒的微生物總生物量(表3、表4)。

圖1 不同間作系統(tǒng)中土壤微生物生物量Fig.1 PLFA of each group of soil microorganisms in different intercropping system

微生物生物量Microbial biomass微生物總生物量Total PLFA叢枝菌根真菌AMF細(xì)菌Bacteria真菌Fungi細(xì)菌/真菌Bacteria/FungiTr1Tr2Tr1Tr2Tr1Tr2Tr1Tr2Tr1Tr2pH0.982-0.485-0.9820.5000.3270.5000.9820.500-0.082-0.459 含水量Moisture content/%-1.000**1.000*1.000**-1.000**-0.5000.500-1.000**0.500-0.108-0.540 有機(jī)質(zhì)Organic matter/(mg/kg)0.3020.505-0.302-0.4900.9771.000**0.3021.000**0.980-0.998*全氮Total nitrogen/(g/kg)0.2760.295-0.276-0.2780.9710.9710.2760.9710.985-0.959 碳氮比C/N-0.2720.7220.272-0.734-0.969-0.221-0.272-0.221-0.9860.175速效鉀Alkali-K/(mg/kg)0.2750.298-0.275-0.2810.9700.9720.2750.9720.986-0.960 速效磷Alkali-P/(mg/kg)0.2770.295-0.277-0.2790.9710.9710.2770.9710.985-0.959

注：**在P<0.01水平上極顯著相關(guān)，*在P<0.05水平上顯著相關(guān)。

Notes：** mean significant correlation atP<0.01 level,* mean significant correlation atP<0.05 level.

表4 果實(shí)膨大期土壤微生物與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of soil microbial community and soil nutrients in fruit enlargement period of apple tree

注：**在P<0.01水平上極顯著相關(guān)，*在P<0.05水平上顯著相關(guān)。

Notes：** mean significant correlation atP<0.01 level,* mean significant correlation atP<0.05 level.

2.4 不同間作系統(tǒng)中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析

分別對(duì)幼果期和果實(shí)膨大期土壤微生物群落進(jìn)行主成分分析，由圖2可知，軸1和軸2將清耕，自然生草和羅勒三種模式顯著分布在三個(gè)不同的區(qū)域，說明在這兩個(gè)時(shí)期三種模式下的土壤微生物群落均有顯著差異。幼果期，微生物總生物量和細(xì)菌與自然生草呈正相關(guān)關(guān)系，真菌、叢枝菌根真菌(AMF)與清耕呈正相關(guān)，細(xì)菌/真菌(B/F)與羅勒呈正相關(guān)。然而，在果實(shí)膨大期，微生物總生物量、細(xì)菌和真菌的豐度與羅勒呈正相關(guān)關(guān)系，細(xì)菌/真菌和叢枝菌根真菌變化不顯著。

圖2 不同間作系統(tǒng)下土壤微生物PLFA主成分分析Fig.2 Principal component analysis of PLFA in soils of different intercropping systems

2.5 不同間作系統(tǒng)中土壤微生物PLFAs與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

對(duì)幼果期和果實(shí)膨大期進(jìn)行冗余分析，軸1和軸2在果樹不同的生長(zhǎng)時(shí)期所占的貢獻(xiàn)率分別為93.61%、99.27%、6.39%、0.73%。由圖3可知，在幼果期，pH與叢枝菌根真菌、微生物總生物量呈正相關(guān)關(guān)系，碳氮比與土壤有機(jī)質(zhì)與細(xì)菌群落呈正相關(guān)關(guān)系；在果實(shí)膨大期，pH與微生物總生物量、細(xì)菌、真菌呈正相關(guān)關(guān)系，碳氮比、土壤含水量、土壤有機(jī)質(zhì)與細(xì)菌/真菌和叢枝菌根真菌呈顯著正相關(guān)。

圖3 土壤PLFA與土壤環(huán)境因子之間的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis of soil microbial community structure and soil physicochemical properties

3 討 論

蘋果樹是重要的經(jīng)濟(jì)果樹，蘋果是人們生活中必不可少的水果。利用科學(xué)環(huán)保的手段改善果園的小生態(tài)環(huán)境、提高果品質(zhì)量一直以來都是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)迫切想要解決的問題之一，間作套種是一種傳統(tǒng)的耕作方式，近年來對(duì)行間間作能夠提高土壤養(yǎng)分及作物產(chǎn)量的研究越來越多[18]，其中植物-土壤的反饋調(diào)節(jié)是目前研究的熱點(diǎn)，通過種植不同種類的植物調(diào)節(jié)土壤微生物群落從而達(dá)到改善土壤環(huán)境、提高土地利用率同時(shí)增加農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)效益的目的。土壤微生物作為土壤中的重要組成部分，承擔(dān)著分解土壤有機(jī)質(zhì)、固定碳素氮素、分泌有機(jī)酸和醇類、促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)的功能，同時(shí)能夠改善土壤理化性質(zhì)、促進(jìn)土壤礦質(zhì)化、改變土壤通氣狀況的作用[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，果園中不同間作模式對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響有顯著差異，且果實(shí)的不同生長(zhǎng)時(shí)期之間也有明顯差異。蘋果園中自然生草和羅勒相較于清耕有效降低土壤pH，且具有很好保水性并增加土壤養(yǎng)分含量，這一結(jié)果與姜黎對(duì)杏樹和苜蓿間作的研究結(jié)果類似，姜黎研究發(fā)現(xiàn)，間作苜蓿有效改善林下土壤理化性質(zhì)及養(yǎng)分狀況，能夠促進(jìn)果樹生長(zhǎng)發(fā)育[20]。自然生草與羅勒相比，后者對(duì)土壤養(yǎng)分的改善更為顯著，如：從土壤有機(jī)質(zhì)、全氮的變化中可以看出羅勒表現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，并且羅勒的土壤pH顯著低于自然生草。在蘋果果實(shí)的不同生長(zhǎng)時(shí)期，由于生物量的積累，果實(shí)生長(zhǎng)后期土壤中的各養(yǎng)分指標(biāo)均高于生長(zhǎng)初期，同時(shí)，對(duì)土壤磷脂脂肪酸的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，羅勒在果實(shí)膨大期表現(xiàn)出很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，微生物總生物量和細(xì)菌、真菌的豐度顯著高于自然生草和清耕，高菲菲對(duì)烤煙間作迷迭和薄荷的研究發(fā)現(xiàn)，間作迷迭有效提高土壤中速效磷和速效鉀的含量[21]。在幼果期，即羅勒的幼苗期，芳香植物生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，因此土壤中微生物生物量低于自然生草，然而到果實(shí)膨大期羅勒生物量逐漸積累，根系發(fā)達(dá)，其根系分泌物中的有機(jī)酸等物質(zhì)有效降低土壤pH，促進(jìn)土壤礦物質(zhì)及土壤有機(jī)質(zhì)的分解，提高土壤養(yǎng)分的含量，促使土壤微生物豐度的增加。有研究表明，紫花羅勒的根系受到病菌的侵害時(shí)，會(huì)分泌大量的迷迭香酸，降低致病幾率。間作迷迭能夠增加土壤中有效磷的含量，其根系分泌物(迷迭香酸)可降低土壤pH，增加土壤中有效磷的活性[22]。

對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，在幼果期，自然生草較羅勒相比生命力頑強(qiáng)且長(zhǎng)勢(shì)好，導(dǎo)致土壤中生草的根系發(fā)達(dá)，根系聚集大量的微生物；然而果實(shí)膨大期即羅勒的盛花期，羅勒生長(zhǎng)旺盛，根系微生物總生物量顯著提高，叢枝菌根真菌、細(xì)菌和真菌的生物量呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)，細(xì)菌/真菌顯示自然生草顯著高于羅勒。這一研究與Bagheri的研究結(jié)果相似[23]。皮爾森相關(guān)性分析表明，土壤含水量和土壤有機(jī)質(zhì)是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子，閆海濤等研究發(fā)現(xiàn)生物炭的添加對(duì)土壤真菌有顯著相關(guān)關(guān)系[24]，且真菌是惰性碳的主要分解者，在有機(jī)物的降解過程中起到重要作用[25]。PCA和RDA結(jié)果表明，在幼果期和果實(shí)膨大期，三種模式(清耕，自然生草，羅勒)各自分布在不同區(qū)域，說明不同種植模式下的微生物群落有顯著差異，其中幼果期自然生草影響細(xì)菌群落的分布；果實(shí)膨大期羅勒對(duì)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)影響更顯著，提高細(xì)菌和真菌的豐度。pH、碳氮比、土壤含水量和土壤有機(jī)質(zhì)是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要土壤生態(tài)因子，其中pH顯著影響真菌群落的分布，其原因可能是由于真菌分解速率較慢，喜好酸性土壤和低營(yíng)養(yǎng)、難分解纖維素和木質(zhì)素以及高碳氮比的有機(jī)物[26]。幼果期碳氮比與細(xì)菌數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，土壤中的固碳細(xì)菌分布范圍廣且很活躍，能夠有效分解土壤有機(jī)質(zhì)。

間作芳香植物后，土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生顯著變化，羅勒由于其根系分泌物的不同，導(dǎo)致其與生草對(duì)微生物群落的影響差異顯著。果園中羅勒和自然生草相比在改善土壤養(yǎng)分、提高土壤微生物活性方面有顯著優(yōu)勢(shì)，間作芳香植物能夠有效改善果園土壤質(zhì)量進(jìn)而提高果實(shí)品質(zhì)，該研究為間作物的篩選提供科學(xué)依據(jù)，為促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的集約化發(fā)展，推進(jìn)現(xiàn)代都市農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供理論支持。