茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌作用的研究

曹 碩，劉 倩，張 昊，王 朕，沈 紅，張永紅

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物類(lèi)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(北京農(nóng)學(xué)院)，北京 102206)

植物精油具有多種生物活性，迷迭香精油是迷迭香次生代謝物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香精油除含有香氣成分,還含有很多藥用成分,如抗菌、抗感染物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、調(diào)節(jié)抗癌物質(zhì)和天然色素等[1]。與迷迭香同科屬的薰衣草，其精油具備較為強(qiáng)烈的芳香氣味，具有鎮(zhèn)靜催眠功能和抗抑郁狂躁特點(diǎn)，還有研究發(fā)現(xiàn)薰衣草具有抗菌、抗氧化、抗凝血性的功能。茶樹(shù)是一種同時(shí)兼有欣賞價(jià)值、香料價(jià)值和藥用價(jià)值等多種價(jià)值屬性的植物，茶樹(shù)精油(Tea Tree oil)是桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(Melaleuca)灌木樹(shù)種-互葉白千層(Melaleucaalternifolia)的新鮮枝葉經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的芳香精油[2]，其具有獨(dú)特的香氣。茶樹(shù)精油具有很強(qiáng)的抗菌效果，是極具價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ募兲烊恢参锞蚚3]。近年來(lái)，對(duì)于精油治療功效的體內(nèi)研究大多是用芳香療法，通過(guò)嗅覺(jué)通路觀察茶樹(shù)精油對(duì)大腦功能的影響，很少有研究涉及到茶樹(shù)精油的抗菌作用。本研究采用藥敏試驗(yàn)確定茶樹(shù)精油的抑菌作用，通過(guò)小鼠感染金黃色葡萄球菌建立肺炎模型，模型小鼠經(jīng)鼻吸入茶樹(shù)精油，通過(guò)分析體重、血常規(guī)、臟器指數(shù)、組織病理變化、肺臟細(xì)菌定殖率等指標(biāo)，探討茶樹(shù)精油通過(guò)小鼠嗅覺(jué)通路對(duì)患肺炎的小鼠影響，為其未來(lái)開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所，茶樹(shù)精油、MHB培養(yǎng)基與瓊脂粉購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，小鼠白介素6(IL-6)試劑盒購(gòu)自中國(guó)湖北伊萊瑞特生物科技有限公司。Leica EG1150石蠟包埋機(jī)、Leica RM2235型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，WFZ-UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，MEK-7222K五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀(日本NIHON KOHDEN公司)。42～56日齡健康昆明小鼠、體重20～22 g，購(gòu)于中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK-(京)2016-0002)。

1.2 方 法

1.2.1 菌懸液制備 稱(chēng)取4.8 g粉末MHB瓊脂培養(yǎng)基加到錐形瓶中并加純水200 mL溶解，密封錐形瓶置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，備用。取200 μL金黃色葡萄球菌菌液加入已滅菌的MHB錐形瓶中，置于搖床過(guò)夜搖10 h，然后取適量過(guò)夜菌加到新的培養(yǎng)基中搖6 h，分光光度計(jì)檢測(cè)其OD值，根據(jù)公式y(tǒng)=1.25x+7.0115(x=OD值)，計(jì)算菌落數(shù)為1×10yCFU/mL。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[4]制備MHB固體培養(yǎng)基，采用涂布法分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌液涂在平皿培養(yǎng)基上，且保證菌液滲透于MHB固體培養(yǎng)基，然后將浸有精油的藥片輕放于涂菌后培養(yǎng)皿相應(yīng)的區(qū)域。

1.2.3 小鼠分組與其感染金黃色葡萄球菌的模型建立 取小鼠隨機(jī)分對(duì)照組、模型組、茶樹(shù)精油組；將小鼠固定麻醉，然后模型組和茶樹(shù)精油組小鼠滴鼻感染金黃色葡萄球菌(2×109CFUs/只)，待小鼠完全吸入菌液后，使其平躺至蘇醒；對(duì)照組小鼠滴鼻等量PBS。

1.2.4 茶樹(shù)精油處理小鼠 小鼠滴鼻感染細(xì)菌2 h后開(kāi)始吸嗅茶樹(shù)精油。

吸嗅方法：首先將盛有2 mL茶樹(shù)精油離心管固定于小鼠玻璃罩中上部，打開(kāi)離心管茶樹(shù)精油揮發(fā)彌漫玻璃罩內(nèi)，然后將茶樹(shù)精油組小鼠置于罩內(nèi)使小鼠吸嗅茶樹(shù)精油30 min，每天2次連續(xù)7 d；同樣方法將模型組和對(duì)照組小鼠置于玻璃罩內(nèi)30 min，但不吸嗅任何精油。

1.2.5 小鼠稱(chēng)重及計(jì)算肺臟指數(shù) 所有小鼠感染前(0 d)稱(chēng)重，然后分別于1、3、5、7 d稱(chēng)重，同時(shí)每組隨機(jī)取4只小鼠采血，頸椎脫臼處死，打開(kāi)腹腔肉眼觀察臟器大小及色澤等，摘取肝、肺、腎、脾臟器稱(chēng)重及拍照。

1.2.6 小鼠血常規(guī)及細(xì)胞因子檢測(cè) 試驗(yàn)結(jié)束后小鼠采血，取部分血液離心制備血清，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)IL-6；另一部分血液用于血細(xì)胞分析儀分析小鼠血常規(guī)指標(biāo)。

1.2.7 細(xì)菌定殖肺臟情況檢測(cè) 無(wú)菌條件取部分肺臟組織稱(chēng)重，然后置于滅菌勻漿器內(nèi)，加2 mL無(wú)菌PBS快速勻漿、離心，取定量上清勻漿液涂抹于MHB固體培養(yǎng)基上，37 ℃生化培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)24 h，最后記錄培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)，按照每毫克肺臟體重，計(jì)算肺臟細(xì)菌定殖數(shù)。

1.2.8 肺臟組織切片的制作與觀察 取肉眼觀察疑似病變肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精/伊紅染色，顯微鏡觀察、拍照。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)分析比較各組數(shù)據(jù)，方差不齊時(shí)用t’檢驗(yàn)，用*和△表示P<0.05即差異顯著，用**和△△表示P<0.01即差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 茶樹(shù)精油對(duì)常見(jiàn)病原菌的抑菌活性分析

按照文獻(xiàn)[5]抗生素抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>15 mm為最敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm為低度敏感，無(wú)抑菌圈為不敏感[3]。本試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)迷迭香精油、茶樹(shù)精油、薰衣草精油的抑菌活性，薰衣草精油組幾乎未有抑菌圈，茶樹(shù)精油組精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌圈直徑分別為12 mm±2.3 mm和10 mm±1.9 mm，呈現(xiàn)良好的抑菌活性，表明金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對(duì)茶樹(shù)精油為中度敏感；圖1顯示茶樹(shù)精油原液有抑菌圈，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌效果，但茶樹(shù)精油經(jīng)5、10和20倍稀釋后沒(méi)有抑菌圈(圖2)。

注:M迷迭香精油、C茶樹(shù)精油、X薰衣草精油。Note: M rosemary, C tea tree, X lavender.圖1 不同植物精油對(duì)金黃色葡萄球菌(A)和大腸桿菌(B)的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effects of different plant essential oils on Staphylococcus aureus (A) and E.coli (B)

注：1為茶樹(shù)精油原液，2、3、4分別為5、10、20倍稀釋的茶樹(shù)精油。Note: 1 means tea tree stock solution, 2 means 5-fold dilution, 3 means 10-fold dilution, 4 means 20-fold dilution.圖2 不同稀釋度的茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌(A)和大腸桿菌(B)的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of different dilutions of tea tree oil on Staphylococcus aureus (A) and E.coli (B)

2.2 小鼠體征變化

試驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠體征變化，對(duì)照組小鼠無(wú)異常體征變化，模型組和茶樹(shù)精油組小鼠在感染細(xì)菌后開(kāi)始表現(xiàn)反應(yīng)強(qiáng)烈，暴躁喜斗，采食減少，大便干結(jié)；但茶樹(shù)精油組小鼠吸嗅茶樹(shù)精油后表現(xiàn)較為溫和，進(jìn)食量增加，尿量增多，體征情況逐漸好轉(zhuǎn)并恢復(fù)至正常。

2.3 茶樹(shù)精油對(duì)小鼠體重和肺臟指數(shù)的影響

試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)不同時(shí)間處理的小鼠稱(chēng)重，結(jié)果隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組小鼠平均體重逐漸增加，均高于模型組和茶樹(shù)精油組；模型組小鼠體重第1天降低、第3天后體重逐漸升高；茶樹(shù)精油組從第1天至第7天小鼠體重逐漸增加且呈上升趨勢(shì)，高于模型組但低于對(duì)照組(圖3)。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對(duì)照組相比，△P<0.05,△△P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.圖3 茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌感染的小鼠體重影響Fig.3 Effects of tea tree oil on the body weight of the mice with pneumonia infected by Staphylococcus aureus

小鼠肺臟指數(shù)變化結(jié)果見(jiàn)圖4，模型組小鼠肺臟指數(shù)逐漸提高；茶樹(shù)精油組小鼠肺臟指數(shù)低于模型組，且小鼠感染細(xì)菌第3天至第7天時(shí)小鼠肺臟指數(shù)接近對(duì)照組(圖4)。

注：與模型組相比，*P<0.05， **P<0.01；與對(duì)照組相比，△P<0.05,△△ P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.圖4 茶樹(shù)精油對(duì)小鼠肺臟指數(shù)的影響Fig.4 Effects of tea tree oil on lung index of the mice

2.4 茶樹(shù)精油對(duì)小鼠炎性細(xì)胞及炎癥因子的影響

采用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠感染細(xì)菌7 d內(nèi)血液中炎性細(xì)胞數(shù)量，對(duì)照組小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)量在1～7 d一直保持相對(duì)較低且不變動(dòng)，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)逐漸增加且顯著高于對(duì)照組，而茶樹(shù)精油組白細(xì)胞數(shù)第1天高于對(duì)照組并與模型組相近，隨后逐漸降低，第3天接近對(duì)照組，第7天升高接近模型組(圖5A)；小鼠血液中中性粒細(xì)胞數(shù)總體變化趨勢(shì)與白細(xì)胞一致，對(duì)照組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)一直保持相對(duì)穩(wěn)定，但顯著低于第1天和第7天模型組，茶樹(shù)精油組第3天小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)明顯降低，且顯著低于模型組(圖5B)。

采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IL-6含量，結(jié)果對(duì)照組小鼠血液IL-6含量從第1天到第7天一直保持相對(duì)穩(wěn)定低于模型組和茶樹(shù)精油組，而茶樹(shù)精油組小鼠第1天血清中IL-6含量略有升高，第3天降低之后一直保持穩(wěn)定水平，且在第3天到第7天低于對(duì)照組(圖6)。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對(duì)照組相比，△P<0.05,△△P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.圖5 茶樹(shù)精油對(duì)小鼠血液中炎性細(xì)胞的影響(A白細(xì)胞，B中性粒細(xì)胞)Fig.5 Effect of tea tree oil on inflammatory cells in blood from the mice (A white blood cell, B neutrophil)

圖6 茶樹(shù)精油對(duì)小鼠血液中IL-6的影響Fig.6 Effect of tea tree oil on IL-6 contents in bloods from the mice

2.5 茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌定殖小鼠肺組織的影響

試驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)小鼠肺組織中金黃色葡萄球菌量，模型組小鼠感染細(xì)菌后1～3 d內(nèi)每毫克肺組織中金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)較高，第5天和第7天其菌落數(shù)極顯著降低；茶樹(shù)精油組小鼠第1天肺組織中菌落數(shù)較高，隨后菌落數(shù)逐漸降低，第3天到第7天顯著減少；對(duì)照組小鼠肺組織中細(xì)菌數(shù)一直保持相對(duì)穩(wěn)定(圖7)。

2.6 茶樹(shù)精油對(duì)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)結(jié)束打開(kāi)小鼠腹腔肉眼觀察肺臟變化，與對(duì)照組相比，模型組小鼠感染細(xì)菌1 d后，肺臟腫脹充血，色澤暗紅，肺葉上均有大小不等和形狀不同的出血斑，肺組織出現(xiàn)腫塊變硬，肺門(mén)淋巴結(jié)腫大、出血；茶樹(shù)精油組小鼠連續(xù)7 d吸嗅茶樹(shù)精油后，肺臟形態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)、出血斑減少、充血減弱，第7天的肺臟顏色變淺呈現(xiàn)淡粉色，質(zhì)地變軟(圖8)。

圖7 茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌定殖小鼠肺臟的影響Fig.7 Effects of tea tree oil on Staphylococcus aureus colonizing in the mice lung

肺組織切片HE染色，與對(duì)照組比較，模型組小鼠感染細(xì)菌后肺組織呈現(xiàn)大量充血，肺泡壁增厚，肺泡組織結(jié)構(gòu)完整性破壞，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)出血；與模型組比較，茶樹(shù)精油組小鼠連續(xù)吸嗅茶樹(shù)精油后，肺組織充血減輕，肺泡壁較厚，肺泡結(jié)構(gòu)完整性逐步恢復(fù)(圖9)。

圖8 小鼠肺臟剖檢肉眼觀察變化Fig.8 Visual observation changes of mouse lung biopsy

圖9 HE染色小鼠第3天肺組織 (100×)Fig.9 HE staining lung tissues from the mice on the third day (100×)

3 討 論

3.1 茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的體內(nèi)外抗菌效果

研究表明，植物精油具有多種生物活性，且具有抗菌作用。湯奕越[6]利用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)肉桂精油、月桂精油及茶樹(shù)精油對(duì)臨床常見(jiàn)病原菌的抑菌活性，茶樹(shù)精油對(duì)所試菌株(鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌及糞腸球菌)抑菌作用較弱。胡憶雪[7]等采用茶樹(shù)精油對(duì)3種痤瘡致病菌(痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)進(jìn)行定性、定量的抗菌性分析，茶樹(shù)精油對(duì)3種痤瘡致病菌均具有良好的抑菌作用,其中對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.15 μL/mL。茶樹(shù)精油對(duì)體外大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌有一定的抑菌作用，其抑菌圈>10 mm；體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠吸入茶樹(shù)精油后肺部細(xì)菌定殖數(shù)顯著降低，結(jié)果與報(bào)道基本一致。

3.2 茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌感染的小鼠肺組織的影響

Morsoleto等[8]研究表明，茶樹(shù)精油可以通過(guò)減少炎癥浸潤(rùn)促進(jìn)損傷肌肉的恢復(fù)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染金黃色葡萄球菌小鼠連續(xù)吸嗅茶樹(shù)精油7 d后，小鼠肺組織充血減輕，肺泡間隙炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡結(jié)構(gòu)完整性逐步恢復(fù)，這可能是茶樹(shù)精油抑菌作用的結(jié)果。體重是動(dòng)物試驗(yàn)中一個(gè)重要的非特異性觀察指標(biāo)[9]，而以器官重量與體重之比得到的臟器系數(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的重要數(shù)據(jù)[10]，臟器系數(shù)高低變化意味著組織器官正常情況[11]。本研究檢測(cè)感染金黃色葡萄球菌的小鼠臟器指數(shù)，結(jié)果只感染細(xì)菌的模型組小鼠體重明顯減輕，肺臟指數(shù)升高，而感染細(xì)菌的小鼠吸嗅茶樹(shù)精油后，其肺臟指數(shù)逐漸降低接近對(duì)照組，說(shuō)明茶樹(shù)精油呈現(xiàn)的抑菌作用能緩解小鼠肺部炎癥，其作用機(jī)理還不清楚有待研究。

3.3 茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠致炎因子及炎性細(xì)胞的影響

IL-6是炎癥急性期合成的重要介質(zhì)，作為一種重要的非特異性炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷[12-13]；肺炎時(shí)致炎因子能激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放一些炎性細(xì)胞因子如IL-6等[14]。IL-6量反映肺炎患者的疾病嚴(yán)重程度，Zobel K[15]和Lee YL[16]研究表明，典型的細(xì)菌性感染可導(dǎo)致體內(nèi)IL-6含量提高。Groppo等[17]發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)精油中的主要成分1,8-桉樹(shù)腦和4-萜烯醇能減輕口腔組織炎癥；茶樹(shù)精油可溶成分可抑制腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-10和前列腺素E2等炎癥因子誘導(dǎo)脂多糖的產(chǎn)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染金黃色葡萄球菌后血液中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞升高、IL-6含量增加，小鼠處于肺炎應(yīng)激狀態(tài)，但小鼠吸嗅茶樹(shù)精油3 d后血液中白細(xì)胞數(shù)下降、IL-6含量降低，茶樹(shù)精油可能通過(guò)降低致炎因子和減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)緩解小鼠肺部炎癥。

綜上所述，茶樹(shù)精油對(duì)體外大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，小鼠吸嗅茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠致肺炎癥狀有一定的緩解作用，研究提示未來(lái)可開(kāi)發(fā)茶樹(shù)精油作為抗炎藥物。