褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花種子抗氧化酶活性及萌發(fā)的影響

陳莉，劉連濤，馬彤彤，江丹，孫紅春，張永江，張科，白志英*，李存東*

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071000）

土壤鹽漬化已經(jīng)成為一個(gè)世界性問題，嚴(yán)重影響了生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[1]。棉花（Gossypium hirsutumL.）是世界上主要的農(nóng)作物之一[2]。隨著環(huán)境的不斷惡化，棉花生產(chǎn)受到的影響日趨嚴(yán)重。種子萌發(fā)是作物生長(zhǎng)過程的重要階段，種子從吸脹后開始發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，為之后的幼苗生長(zhǎng)提供儲(chǔ)備；并且種子萌發(fā)也決定作物的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而最終影響產(chǎn)量[3]。鹽害導(dǎo)致的種子萌發(fā)和出苗障礙是棉花豐產(chǎn)高效的重要限制因子。鹽脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)含有大量的Na＋和Cl-，打破了植物體內(nèi)動(dòng)態(tài)離子平衡，使細(xì)胞吸收水分受阻，從而降低了種子萌發(fā)率，抑制了根長(zhǎng)伸長(zhǎng)；鹽脅迫亦能影響植物正常的新陳代謝，破壞植物膜系統(tǒng)的活性氧自由基，植物的抗氧化酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（Peroxidase,POD）、過氧化氫酶（Catalase,CAT）活性迅速降低，丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量升高[4]。鹽脅迫下，植物通過增加滲透調(diào)節(jié)物為其代謝發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而減少鹽脅迫造成的傷害。因此研究鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)及調(diào)控具有重要意義。

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺）屬于吲哚雜環(huán)類化合物，是存在于從藻類到人類眾多生物中的一類激素[5]。研究表明，褪黑素能增強(qiáng)植物種子生物和非生物脅迫的耐受性。褪黑素處理增加了大豆種子豆莢數(shù)和種子數(shù)，提高了大豆產(chǎn)量[6]。低溫下褪黑素處理菘藍(lán)種子，降低了膜脂過氧化損傷，保護(hù)了酶活性，提高吲哚乙酸含量，刺激了植物生長(zhǎng)[7]。李本峰等[8]研究表明，褪黑素浸種提高了聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）脅迫下黑麥草種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，根系的鮮物質(zhì)質(zhì)量和根冠比也隨之增加。蔣航等[9]證實(shí)了施加外源褪黑素可以有效緩解As3＋脅迫對(duì)水稻種子萌發(fā)的抑制作用，提高了發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。同時(shí)As3＋脅迫下，水稻中的酶和蛋白質(zhì)上的巰基發(fā)生反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性下降，外源施加50 μmol·L-1和100 μmol·L-1褪黑素均能緩解抗氧化酶的抑制作用。褪黑素處理降低了逆境下水稻MDA 含量，緩解了膜脂過氧化作用，減少了活性氧積累和細(xì)胞膜傷害[9-10]。褪黑素預(yù)處理增強(qiáng)了鹽脅迫下玉米種子的萌發(fā)活性，提高了抗逆性[11]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外專家研究了鹽脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響[12]。但有關(guān)外源褪黑素對(duì)棉花種子萌發(fā)性狀的調(diào)控效應(yīng)還未見報(bào)道。因此，本研究以國(guó)欣棉9號(hào)為材料，研究外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)、抗氧化酶活性和MDA 含量的影響，為褪黑素的開發(fā)利用和棉花耐鹽品種選育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2019年在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行。

1.1 供試材料

國(guó)欣棉9號(hào)，由河間市國(guó)欣農(nóng)村技術(shù)服務(wù)總會(huì)提供。

1.2 NaCl 脅迫濃度篩選

選取顆粒飽滿大小一致的棉花種子，用75%酒精消毒15～20 min，蒸餾水沖洗4 次，將棉花種子放在陰涼通風(fēng)處晾干。種子放于內(nèi)鋪兩層發(fā)芽紙的白瓷盤中，用移液槍施加等量不同濃度的鹽溶液（0、50、100、150、200 mmol·L-1）。每處理重復(fù)3 次，每次500 粒棉花種子，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，溫度25 ℃，黑暗條件且保持培養(yǎng)箱濕度飽和。每天定時(shí)定點(diǎn)向白瓷盤中施加等量不同濃度的鹽溶液，以發(fā)芽為標(biāo)準(zhǔn)，記錄種子萌發(fā)數(shù)。

1.3 試驗(yàn)處理

種子消毒后，晾干。以預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的150 mmol·L-1NaCl 為適宜的鹽脅迫濃度，設(shè)置6個(gè)不同褪黑素（Melatonin,MT）濃度處理。

CK1： 0 NaCl＋0 MT；

CK2： 150 mmol·L-1NaCl＋0 MT；

MT10： 150 mmol·L-1NaCl ＋10 μmol·L-1MT；

MT20： 150 mmol·L-1NaCl ＋20 μmol·L-1MT；

MT50： 150 mmol·L-1NaCl ＋50 μmol·L-1MT；

MT100：150 mmol·L-1NaCl ＋100 μmol·L-1MT。

先將種子浸泡在各濃度溶液中24 h，隨后在通風(fēng)處晾干（2 d），恢復(fù)初始含水量（浸種前后種子重量未發(fā)生明顯變化）。將種子均勻放于直徑15cm的培養(yǎng)皿（內(nèi)鋪浸泡鹽水的無(wú)菌濾紙）中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱，黑暗條件培養(yǎng)7 d，保持各培養(yǎng)皿含水量相同。每處理重復(fù)3 次，每次500粒種子。

1.4 種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)測(cè)定

棉花種子萌發(fā)周期為7 d，以放入培養(yǎng)箱當(dāng)天為標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄發(fā)芽數(shù)。以第7 d 發(fā)芽總數(shù)來(lái)計(jì)算發(fā)芽率，并以第3 d 發(fā)芽數(shù)為指標(biāo)計(jì)算發(fā)芽勢(shì)。

發(fā)芽率＝第7 天總發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)＝第3 天總發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%

1.5 種子胚根長(zhǎng)度測(cè)定

種子萌發(fā)7 d 后，每個(gè)處理各取20 粒種子，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量各處理的胚根長(zhǎng)度，每處理重復(fù)3 次。

1.6 種子萌發(fā)后的生物量（干物質(zhì)質(zhì)量、鮮物質(zhì)質(zhì)量）測(cè)定

種子萌發(fā)至第7 d，分別對(duì)6個(gè)不同濃度褪黑素處理組進(jìn)行取樣。每個(gè)組取100 粒種子，用吸水紙將種子擦拭干凈，利用分析天平稱量種子鮮物質(zhì)質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。然后105 ℃殺青15 min，85 ℃烘至恒重，稱量干物質(zhì)質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。每處理重復(fù)3 次。

1.7 抗氧化酶系活性測(cè)定

分別取不同濃度褪黑素處理組，萌發(fā)至第2 d、4 d、6 d的種子0.5 g，放入研缽中（研缽-20 ℃預(yù)冷1 h）按1∶9 加入預(yù)冷的磷酸緩沖液（PBS pH7.0 含1% 聚乙烯吡咯烷酮和0.1%巰基乙醇）冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，1 000 r·min-1冷凍離心20 min，吸取上清液置于4 ℃保存，待用。

SOD 活性測(cè)定。根據(jù)Zhang等[13]的方法稍作改良。取4 mL 反應(yīng)液，包括2 mL pH7.8 磷酸緩沖液、0.5 mL 104 mmol·L-1蛋氨酸、1 mL 300 μmol·L-1氮蘭四唑、0.5 mL 0.8 mmol·L-1乙二胺四乙酸于試管中，加入50 μL 提取液、50 μL 核黃素。另取1 支試管：加入反應(yīng)液，不加酶液處理作為最大光還原管。將所有試管置于4 000 LX 熒光燈下進(jìn)行還原反應(yīng)。15 min 后，用黑紙遮光，終止反應(yīng)。用pH7.8 磷酸緩沖液調(diào)零點(diǎn)。在560 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)得各個(gè)樣品OD 值。

POD 活性測(cè)定。根據(jù)Zhang等[13]的方法稍作修改。取2.98 mL 反應(yīng)液，即pH7.0 磷酸緩沖液2.91 mL，20 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚0.05 mL，40 mmol·L-1過氧化氫0.02 mL。加入20 μL 酶提取液于試管中，充分混合后，在34 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3 min。最后加入20%三氯乙酸20 μL，終止酶活性，以pH7.0的磷酸緩沖液調(diào)零點(diǎn)，在470 nm 波長(zhǎng)下測(cè)得各個(gè)樣品OD 值。

CAT的活性測(cè)定。根據(jù)Liu等[14]加以修改。配制反應(yīng)液0.1 mol·L-1過氧化氫5 mL，加入0.1 mol·L-1pH7.0的磷酸緩沖液20 mL 混勻，即為CAT 反應(yīng)液。取2.5 mL 反應(yīng)液，加入200 μL 酶提取液。25 ℃預(yù)熱后逐管加入0.1 mol·L-1過氧化氫0.3 mL。每加完一管立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色皿，240 nm 處測(cè)其OD 值，每隔1 min讀數(shù)1 次，共測(cè)4 次。

1.8 丙二醛含量測(cè)定

MDA 活性測(cè)定參考Cui等[15]的方法稍作修改。用pH7.0的預(yù)冷磷酸緩沖液充分研磨，12 000 r·min-1離心10 min，取上清即為組織提取液。吸取2 mL的提取液置于刻度試管中，加入用0.5%硫代巴比妥酸配制成的5%三氯乙酸溶液3 mL，于沸水浴上加熱10 min，迅速冷卻。于6 000 r·min-1離心10 min，取上清于532 nm、600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以蒸餾水為對(duì)照調(diào)透光率為100%。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用IBM SPSS statistics 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 濃度的篩選

如圖1 所示，不施加鹽溶液的棉花種子發(fā)芽率較高（90.27%），施加不同濃度鹽溶液后，棉花種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。表明鹽脅迫抑制了棉花種子萌發(fā)，且隨著鹽濃度的增加，棉花種子發(fā)芽率逐漸降低。在50 mmol·L-1、100 mmol·L-1NaCl處理下，較對(duì)照組分別下降了1.57 百分點(diǎn)，2.74 百分點(diǎn)。在150 mmol·L-1NaCl處理下，棉花種子發(fā)芽率下降了27.70 百分點(diǎn)，明顯抑制了種子萌發(fā)。而在200 mmol·L-1NaCl處理下，棉花種子萌發(fā)率僅為48.13%，表明鹽濃度越高，死亡的棉花種子數(shù)越多。因此，150 mmol·L-1NaCl 為本試驗(yàn)鹽脅迫的適宜濃度。

圖1 NaCl 濃度對(duì)棉花種子發(fā)芽率的影響Fig. 1 Effect of NaCl solutions on germination rate of cotton seeds

2.2 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)的影響

由圖2A 可知，CK1（蒸餾水）條件下棉花種子發(fā)芽率為89.56%，CK2（150 mmol·L-1NaCl）處理下發(fā)芽率為74.44%，較CK1降低了15.12 百分點(diǎn)，二者呈顯著差異。表明鹽脅迫抑制了棉花種子萌發(fā)，降低了發(fā)芽率。而當(dāng)施加褪黑素之后，不同濃度褪黑素處理對(duì)NaCl 脅迫下棉花種子的發(fā)芽率具有一定影響，隨著濃度的不斷增加，棉花種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。與CK2相比，MT10、MT20、MT50、MT100發(fā)芽率分別增加了5.86 百分點(diǎn)，8.45 百分點(diǎn)，0.2 百分點(diǎn)，-1.22 百分點(diǎn)。其中以MT20（20 μmol·L-1）褪黑素濃度處理的種子發(fā)芽率最高，為82.89%，但隨著褪黑素濃度不斷增加，MT50、MT100處理的種子發(fā)芽率與CK2無(wú)顯著差異，甚至稍微低于CK2，表明高濃度的褪黑素可能會(huì)抑制種子萌發(fā)。

發(fā)芽勢(shì)是判斷種子生命力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。由圖2B 可知，CK1發(fā)芽勢(shì)最高，為84.97%，CK2發(fā)芽勢(shì)為72.41%，較CK1降低了12.56 百分點(diǎn)，二者之間差異顯著，表明鹽脅迫同樣抑制了棉花種子的生命活力。當(dāng)外源施加褪黑素之后，發(fā)芽勢(shì)亦呈先增加后降低的趨勢(shì)，與CK2相比，MT10、MT20、MT50、MT100發(fā)芽勢(shì)分別增加了4.8 百分點(diǎn)，5.3 百分點(diǎn)，-0.57，-1.02。其中20 μmol·L-1褪黑素濃度處理的種子發(fā)芽勢(shì)最高，為77.71%。隨褪黑素濃度逐漸上升，MT50和MT100處理的種子發(fā)芽勢(shì)略低于CK2，說明低濃度褪黑素能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，而高濃度褪黑素則可能會(huì)抑制種子萌發(fā)。

2.3 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子胚根長(zhǎng)度的影響

從圖3 可以看出，CK1胚根最長(zhǎng)為2.81cm，而CK2胚根為1.72cm，相較于CK1下降了38.67%，且二者差異顯著。表明鹽脅迫抑制了棉花胚根生長(zhǎng)，當(dāng)外源施加不同褪黑素濃度時(shí)，胚根長(zhǎng)呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢(shì)。在20 μmol·L-1褪黑素濃度處理下，棉花種子胚根達(dá)到最長(zhǎng)，相較于CK2增加了54.93%，二者之間差異顯著。其他處理MT10、MT50、MT100也均高于CK2，但與CK2相比無(wú)顯著差異，說明在鹽脅迫下，褪黑素能夠促進(jìn)棉花種子胚根的伸長(zhǎng)，解除鹽脅迫的抑制作用。但是，在MT50、MT100褪黑素濃度下，胚根增加緩慢。說明低濃度褪黑素處理具較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

圖2 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子發(fā)芽率（A）、發(fā)芽勢(shì)（B）的影響Fig. 2 Effect of melatonin on germination rate（A）, germination potential（B）of cotton seeds under NaCl stress

圖3 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子胚根長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effect of melatonin on radical length of cotton seeds under NaCl stress

2.4 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)后的生物量的影響

如圖4 所示，對(duì)照（CK1）條件下，棉花種子干物質(zhì)質(zhì)量和鮮物質(zhì)質(zhì)量較高，而鹽脅迫下，棉花種子干物質(zhì)質(zhì)量和鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著下降，施加褪黑素后，MT20處理的棉花種子的干物質(zhì)質(zhì)量和鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著高于CK2，而MT50、MT100處理則與CK2相比無(wú)顯著性差異。其中MT20處理的棉花種子的干物質(zhì)質(zhì)量和鮮物質(zhì)質(zhì)量最高，表明適宜濃度褪黑素能夠促進(jìn)棉花種子內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，為后期棉花種子萌發(fā)提供了生物量積累。

圖4 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)后生物量的影響Fig. 4 Effect of melatonin on seeds biomass of cotton under NaCl stress

2.5 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子抗氧化酶活性的影響

SOD 為生物體內(nèi)活性酶類，能夠消除植物體內(nèi)新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。植物體內(nèi)SOD 可分為3種類型CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。植物種子經(jīng)過處理后Mn-SOD、Fe-SOD活力喪失，但CuZn-SOD 活力不變，即為總的SOD 活力[16]。由圖5A 可知，各個(gè)時(shí)期SOD 活性變化趨勢(shì)基本一致。在種子萌發(fā)的不同時(shí)期（2 d、4 d、6 d），對(duì)照CK1處理的SOD 活性較高，而鹽脅迫（CK2）處理后，SOD 活性明顯降低，2 d、4 d、6 d分別比CK1降低了4.75%、4.20%和8.44%。表明鹽脅迫破壞了細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能，抑制了SOD 活性。當(dāng)外源施加不同濃度褪黑素時(shí)，SOD活性隨著褪黑素濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)褪黑素濃度為20 μmol·L-1時(shí)，SOD 活性最高，2 d、4 d、6 d的SOD 活性分別為2 016.50 U·g-1、2 104.82 U·g-1、1 867.85 U·g-1，與CK2相比SOD 活性分別提高了7.95%、9.69%、12.85%，且存在顯著性差異，說明低濃度褪黑素促進(jìn)了SOD 活性提高。

POD 活性反應(yīng)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育特性，其活力變化趨勢(shì)與SOD 較為一致，但變化幅度較大（圖5B）。隨著種子萌發(fā)時(shí)間的增加，POD 總體活性呈先升后降趨勢(shì)。在種子萌發(fā)2 d、4 d 和6 d時(shí)，CK1處理下的POD 活性分別為43.38 U·mg-1、53.66 U·mg-1、46.96 U·mg-1，而鹽脅迫CK2處理下，POD 活性在2 d、4 d、6 d分別比CK1降低了16.87%、11.07%、7.69%，說明鹽脅迫抑制了POD 活性。隨著褪黑素濃度的不斷增加，POD活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。施加20 μmol·L-1褪黑素時(shí)，POD 活性達(dá)到最高，與CK2相比分別增加了107.15%（2 d）、76.91%（4 d）和55.55%（6 d），差異顯著。其他處理組MT50和MT100與CK2相比分別上升了60.23%（2 d）和77.65%（2 d），-10.25%（4 d）和6.31%（4 d），25.67%（6 d）和36.14%（6 d）。說明低濃度的褪黑素對(duì)POD 活性存在促進(jìn)作用。

圖5 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子SOD（A）、POD（B）和CAT（C）活性的影響Fig. 5 Effect of melatonin on SOD (A)、POD (B) and CAT (C) activity of cotton seeds under NaCl stress

CAT的活性變化與SOD、POD 大體相同。隨棉花種子萌發(fā)，CAT 活性逐漸減弱（圖5C）。在各個(gè)時(shí)期內(nèi)，CK1活力最高，分別為：20.58 U·mL-1、20.46 U·mL-1、18.42 U·mL-1，鹽脅迫處理之后，CK2比CK1分別下降了28.47%（2 d）、40.81%（4 d）、22.97%（6 d）。當(dāng)外源施加不同濃度褪黑素時(shí)，CAT 活性隨褪黑素濃度升高呈先升后降的變化趨勢(shì)。在20 μmol·L-1處理下CAT 活性最高，分別為19.48 U·mL-1（2 d）、19.41 U·mL-1（4 d）、18.45 U·mL-1（6 d）,與CK2相比，處理2 d、4 d、6 d分別增加了32.33%、60.27%、30.07%，但在高濃度100 μmol·L-1處理下差異并不明顯，有的甚至低于鹽脅迫處理。

綜上所述，低濃度的褪黑素處理可增加鹽脅迫下棉花種子內(nèi)抗氧化酶活力，促進(jìn)棉花正常生長(zhǎng)。與SOD、POD 比較而言，褪黑素對(duì)POD的調(diào)控效應(yīng)更為明顯。

2.6 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下丙二醛含量影響

膜脂過氧化對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生傷害，并最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。MDA 是反映植物細(xì)胞膜脂過氧化作用的重要指標(biāo)。從圖6 可以看出，MDA 含量隨時(shí)間推移持續(xù)升高，均在處理6 d時(shí)達(dá)到最高水平。鹽脅迫下2 d、4 d、6 d時(shí)，處理組CK2含量分別為2.11 μmol·g-1、2.48 μmol·g-1、2.77 μmol·g-1，分別比CK1升高了13.36%（2 d）、23.70%（4 d）、34.19%（6 d），說明鹽脅迫導(dǎo)致膜脂過氧化作用進(jìn)一步加劇。褪黑素處理之后，MDA 含量呈整體下降趨勢(shì)，其中MT20處理下MDA 含量最低，較CK2分別下降了39.46%（2 d）、27.62%（4 d）、34.42%（6 d），差異顯著。表明20 μmol·L-1褪黑素處理有效減少了棉花種子的膜脂過氧化作用，有利于其正常生長(zhǎng)發(fā)育。

圖6 褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花種子MDA 含量的影響Fig. 6 Effect of melatonin on MDA content of cotton seeds under NaCl stress

3 討論

3.1 褪黑素對(duì)種子萌發(fā)的調(diào)控效應(yīng)

鹽害是影響作物棉花種子萌發(fā)和出苗障礙的主要限制因素。棉花是一種耐鹽性較強(qiáng)的作物。蔣玉蓉等[17]研究表明，低濃度鹽能促進(jìn)棉花根部和地上部生長(zhǎng)，有利于棉花出苗，但濃度過高會(huì)對(duì)棉花產(chǎn)生危害。本研究表明，低濃度（50、100 mmol·L-1NaCl）鹽處理下，棉花種子發(fā)芽率稍有降低，高濃度（150、200 mmol·L-1NaCl）鹽處理下，棉花種子發(fā)芽率顯著下降，因而150 mmol·L-1NaCl 作為本試驗(yàn)鹽脅迫的適宜濃度。

褪黑素又名褪黑激素，是一種胺類激素，在植物逆境和種子萌發(fā)中具有重要調(diào)控作用。蔡蕓菲[18]研究表明，利用赤霉素（Gibberellin acid,GA）、激動(dòng)素（Kinetin, KT）、油菜素內(nèi)酯（Brassinolide,BR）等激素對(duì)種子進(jìn)行引發(fā)處理，導(dǎo)致內(nèi)滲物增多，易使病原菌繁殖，種子出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。徐暑暉[11]研究表明，低濃度（10 μmol·L-1）褪黑素處理能有效促進(jìn)鹽脅迫下玉米種子萌發(fā)，緩解了種子的鹽害作用，提高了耐鹽性。Zhang等[19]研究指出，褪黑素通過調(diào)節(jié)脫落酸（Abscisic acid, ABA）和GA4的生物合成和分解代謝來(lái)減輕NaCl脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的抑制作用。李娟起[20]研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol·L-1褪黑素浸種能緩解自毒物質(zhì)對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的傷害作用，提高黃瓜種子在非生物脅迫下種子側(cè)根的形成。李鵬輝等[21]研究表明，褪黑素處理能增強(qiáng)干旱脅迫下煙草的抗氧化酶活性，增加滲透調(diào)節(jié)物積累，緩解脅迫造成的傷害。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施加低濃度褪黑素（10、20 μmol·L-1）能夠有效緩解鹽脅迫對(duì)棉花種子的傷害作用，促進(jìn)種子萌發(fā)，提高了種子發(fā)芽率，其中20 μmol·L-1褪黑素濃度處理下棉花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)最高。

3.2 褪黑素對(duì)種子萌發(fā)后的生物量和胚根的調(diào)控效應(yīng)

鹽脅迫導(dǎo)致細(xì)胞失水，細(xì)胞壁破裂，甚至死亡[22-23]。宋雪飛等[23]研究表明，鹽脅迫下褪黑素提高了水稻幼苗K＋的選擇性吸收，維持體內(nèi)離子動(dòng)態(tài)平衡，增加了生物量；蔣航等[9]研究發(fā)現(xiàn)，砷脅迫等明顯抑制了水稻根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，褪黑素能緩解砷的毒害作用，增加水稻根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)；林曉金等[24]研究證實(shí)了50 mg·L-1褪黑素浸種水稻，增加了秧苗根數(shù)和根系活力；Zeng等[22]研究表明，適宜褪黑素濃度能提高油菜籽的芽和根的鮮物質(zhì)質(zhì)量與干物質(zhì)質(zhì)量，能抵抗鹽脅迫造成的滲透?jìng)?。本試?yàn)研究發(fā)現(xiàn)，施加低濃度褪黑素（10、20 μmol·L-1）處理增加了棉花種子萌發(fā)后的生物量（干物質(zhì)質(zhì)量和鮮物質(zhì)質(zhì)量）以及胚根長(zhǎng)，其中20 μmol·L-1褪黑素處理的棉花種子萌發(fā)后的生物量和胚根長(zhǎng)最高，表明低濃度褪黑素能夠促進(jìn)棉花種子內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累以及根的發(fā)育。

3.3 褪黑素對(duì)種子抗氧化酶活性的調(diào)控效應(yīng)

鹽脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)由于Na＋過量積累，導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）產(chǎn)生，打破了清除系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，從而啟動(dòng)膜脂過氧化及脫脂作用，膜結(jié)構(gòu)受到破壞，MDA 含量增加[25-26]。此時(shí)SOD、POD、CAT 活性在一定程度上發(fā)生變化，以維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。褪黑素是高親脂性和部分親水性的化合物，其吲哚環(huán)5 位上的甲氧基和側(cè)鏈上的N-乙?；峭屎谒厍宄钚匝醯谋匦杌鶊F(tuán)，因此外源施加褪黑素能夠與活性氧自由基發(fā)生反應(yīng)，協(xié)助抗氧化酶系共同作用，增強(qiáng)褪黑素對(duì)ROS的清除作用[27]。Kostopoulou等[28]研究表示，鹽脅迫下外源施加褪黑素增加了酸橙根部SOD 和葉中POD 含量。王偉香[29]研究表明，鹽脅迫初期，黃瓜幼苗中CAT活性迅速升高，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CAT 活性逐漸降低，說明鹽脅迫抑制了CAT 活性，施加50 μmol·L-1褪黑素后CAT 活性達(dá)到最高。Zhang等[13]研究表明，水脅迫下黃瓜種子中MDA 含量增加，氧化傷害加重，施加300 μmol·L-1褪黑素可有效抑制MDA 含量。本研究結(jié)果顯示，低濃度的褪黑素（10、20 μmol·L-1）提高了鹽脅迫下棉花種子SOD、POD、CAT 活性，降低了膜脂過氧化程度，提高了種子耐鹽能力。其中20 μmol·L-1處理抗氧化酶活性最高，MDA 含量最低，表明褪黑素通過抑制膜脂過氧化作用產(chǎn)生，緩解鹽脅迫對(duì)棉花種子的損傷。

綜上所述，通過外源施加適宜濃度褪黑素能降低ROS 含量和提高抗氧化酶活力，為棉花的新陳代謝提供一個(gè)較為穩(wěn)固的環(huán)境，減緩鹽脅迫對(duì)棉花種子的傷害，提高了耐鹽性，因而在棉花生產(chǎn)中可以利用。

4 結(jié)論

低濃度的褪黑素（10、20 μmol·L-1）能夠促進(jìn)棉花種子萌發(fā)，促進(jìn)胚根增長(zhǎng)，增加干物質(zhì)的積累量，提高了抗氧化酶活力，增強(qiáng)了種子耐鹽性；高濃度褪黑素（50、100 μmol·L-1）抑制了棉花種子萌發(fā)。其中，在鹽脅迫下棉花種子的萌發(fā)過程中，褪黑素的最適調(diào)控濃度為20 μmol·L-1，該研究結(jié)果為褪黑素的開發(fā)利用以及棉花抗鹽性研究提供了理論依據(jù)。