棉花FAD2-1基因的RNAi載體構(gòu)建及高油酸新種質(zhì)的獲得

徐孝蘭，許忠平，郭小平

（華中農(nóng)業(yè)大學植物與科學技術(shù)學院/作物遺傳改良國家重點實驗室，湖北武漢430070）

油酸屬于單不飽和脂肪酸，高油酸食用油可降低人體血液中有害的低密度脂蛋白，防止動脈硬化[1]；避免有害的反式脂肪酸的產(chǎn)生[2]；氧化穩(wěn)定性較高，氧化產(chǎn)物少，可延長植物油產(chǎn)品保質(zhì)期[3]。

△12-脂肪酸去飽和酶（△12 Fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）是膜結(jié)合蛋白，屬于脂酰脂去飽和酶類，可在單不飽和脂肪酸第12 和13 位碳原子之間引入1個雙鍵，催化油酸向亞油酸的生物轉(zhuǎn)換，是植物產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶[4]。FAD2 屬于△12-脂肪酸去飽和酶中的一種。目前，在棉花中FAD2 基因根據(jù)其位點和表達模式分為4種類型，即FAD2-1，F(xiàn)AD2-2，F(xiàn)AD2-3 和FAD2-4。其中，F(xiàn)AD2-1 在種子中特異表達[5]。近年來，獲得高油酸含量的油料作物成為研究熱點。在大豆上，通過轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）技術(shù)對FAD2-1 兩條同源基因進行誘變，有3個FAD2-1 突變株系可穩(wěn)定遺傳到下一代；在突變純合的植株中，種子的脂肪酸組成發(fā)生顯著變化，油酸從20%增加到80%，亞油酸從50%減少到4%以下[6]。Jiang等[7]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除亞麻薺（Camelina sativa）的FAD2 基因，成功提高了亞麻籽油酸含量，將亞麻籽的油酸含量從16%提高到50%以上，亞油酸從16%降低至4%以下，亞麻酸從35%降低至10%以下。棉籽作為棉花生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品，生產(chǎn)量約是纖維的1.6 倍，總產(chǎn)量巨大[8-9]。若能在保證棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)不受影響，也不增加耕地面積的前提下，提高棉籽中油酸的含量，對改善我國棉籽油的品質(zhì)具有重要意義。本研究選擇控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因GhFAD2-1，構(gòu)建RNA 干擾（RNA interference,RNAi）載體[10]，轉(zhuǎn)化棉花，并通過對其后代多年多點種植，驗證遺傳穩(wěn)定性，以期創(chuàng)造能夠穩(wěn)定遺傳的高油酸、低亞油酸棉花種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1材料與試劑。以陸地棉（Gossypium hirsutumL.）豫早1號（YZ1）為轉(zhuǎn)化受體。

植物基因組DNA 提取試劑盒、總RNA 提取試劑盒、快速小提質(zhì)粒試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；TA 連接反應(yīng)試劑購自TRANGEN BIOTECH 公司；常規(guī)PCR 試劑購自TRANGEN BIOTECH 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑購自PROMEGA 公司；qRT-PCR 試劑購自BIO-RAD 公司。脂肪酸提取所用試劑： 色譜級正己烷、甲醇均購自SIGMA公司。PCR 引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2菌株與載體。大腸桿菌菌株Top10 和DB3.1 以及農(nóng)桿菌菌株EHA105 由本實驗室提供和保存。TA 克隆載體為pGEM-T Easy；干涉載體為pHellsgate4；載體由本實驗室改造、提供和保存。

1.2 試驗方法

1.2.1目的基因檢索。在NCBI 上查找陸地棉FAD2-1（GenBank:HQ259410.1）的序列。

1.2.2目的基因的生物信息學分析。利用ExPASy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測目標基因蛋白的理化性質(zhì)。利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站預(yù)測目的基因蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析目標基因蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.3引物設(shè)計。BLAST 比對GhFAD2-1的保守區(qū)域，利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計特異性引物，引物長度15～30 bp，GC 含量在40%～60%；合成引物FAD2-1F：5’-ACGTTTCGGGTCGATACTATGA-3’和FAD2-1R：5’-TCGTTGAGAAGAGGTGATGAGC -3’，擴增GhFAD2-1基因部分序列，用于構(gòu)建干涉載體pHellsgate4-FAD2-1。

1.2.4干涉載體的構(gòu)建。取YZ1的30 d 胚珠，于液氮中研磨成粉末，提取RNA，測定濃度與質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以YZ1的cDNA 為模板，引物FAD2-1F 和FAD2-1R 擴增GhFAD2-1基因部分序列。PCR 體系為：cDNA 模板10 ng、Easy taq 0.2 μL、10×buffer 2 μL、dNTP 0.3 μL、FAD2-1F/FAD2-1R 10 μmol-10.2 μL，ddH2O 補充至總體積20 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃40 s，28個循環(huán)（從第二步開始循環(huán)），72 ℃10 min，15 ℃5 min?；厥债a(chǎn)物，TA 克隆將PCR 片段鏈接至pGEM-T Easy 載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，經(jīng)陽性鑒定后，挑選陽性克隆送武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。擴增片段為381 bp，測序結(jié)果利用BioEdit 和DNAMAN V6 軟件與已知序列進行對比作圖（圖2），挑選正確序列的菌液，提質(zhì)粒。

合成帶有attB 接頭的引物，上游引物B-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTACGTTTCGGGTCGATACTATGA -3’，下游引物B-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCGTTGAGAAGAGGTGATGAGC-3’，以正確序列的質(zhì)粒為模板進行PCR，獲得所需的含有attB 接頭的目的片段，回收，將目的片段連接到干涉表達載體pHellsgate4 上。連接反應(yīng)體系： 目的片段1.0 μL、pHellsgate 41.0 μL、TE buffer 2.0 μL、BP 酶1.0 μL。將反應(yīng)后的重組載體，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Top10 中，以35s 啟動子堿基序列設(shè)計的引物作為上游引物35s-F：5’-TTGATGTGACATCTCCACTGACGTAA-3’，以YFAD2-1-R 為下游引物鑒定陽性，YFAD2-1-R：5’-ACAAGGAAGGCATTCACAATAAGTAGAGG-3’。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃5 min，95℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃40 s，30個循環(huán)（從第二步開始循環(huán)），72 ℃10 min，15 ℃5 min。PCR 陽性的菌液提取質(zhì)粒，分別用XbaⅠ和XhoⅠ單酶切。XhoⅠ/XbaⅠ0.4 μL、BSA 0.5 μL、Cutsmart 4×Buffer 2 μL、BP 質(zhì)粒8 μL，ddH2O 補充至總體積20 μL。酶切驗證完成后獲得RNA 干涉載體。

1.2.5遺傳轉(zhuǎn)化。將上述獲得的RNA 干涉載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，用農(nóng)桿菌侵染YZ1 下胚軸共培養(yǎng)36～48 h，經(jīng)過篩選培養(yǎng)、分化成胚及誘導成苗獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.6轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定。取幼嫩葉片提取DNA，利用2 對引物，NPTⅡ-F：5’-TTGTCACTGAAGCGGGAAGG-3’ 和NPTⅡ-R：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’、35s-F 和YFAD2-1R 對轉(zhuǎn)基因植株進行陽性鑒定，擴增出目的條帶的為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.2.7Southern blotting 檢測。取幼嫩葉片，用植物基因組DNA 提取試劑盒精提棉花DNA，并進行濃度及質(zhì)量檢測，擴增NPTⅡ的部分序列為探針，標記，應(yīng)用地高辛（DIG）試劑盒，對陽性植株進行Southern 雜交，檢測拷貝數(shù)。

1.2.8轉(zhuǎn)基因植株實時熒光定量PCR。取陸地棉“YZ1”T4轉(zhuǎn)基因植株30 d 胚珠的cDNA 進行實時熒光定量PCR 分析。以GhUB7 為內(nèi)標基因，引物為UB7-QRT-F 和UB7-QRT-R。目的基因引物為FAD2-QRT-F：5’-AGGATGCCAGTTGACGGTATAA -3’ 和FAD2-QRT-R：5’-TAGGAGAAGGATCGAAGGAGGG-3’。熒光定量PCR體系為：100×cDNA 7 μL、SybrGreen-mix（BIOBAD 公司）7.5 μL、Primer F/R 10 μmol-10.25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，1個循環(huán)；95 ℃5 s，60 ℃35 s，40 循環(huán)。

1.2.9種子含油量與脂肪酸含量測定。將濃硫酸脫絨后的成熟種子晾曬2～3 d，取飽滿的種子用核磁共振分析儀測量含油量。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）測定種子脂肪酸含量。

1.2.10農(nóng)藝性狀及纖維品質(zhì)考察。在植株吐絮后期測定農(nóng)藝性狀，包括始果枝節(jié)位（自子葉節(jié)起由下而上數(shù)計第一果枝著生節(jié)位數(shù)）、果枝數(shù)（自第一果枝節(jié)位（計為1）至植株頂端果枝的數(shù)目）、葉枝數(shù)（自第一葉枝節(jié)位（計為1）至植株頂端之間的葉枝數(shù)目）、有效鈴數(shù)（鈴的直徑大于20 mm）、株高（從子葉節(jié)起至主莖生長點的高度）、平均單鈴籽棉重（隨機取的20個中部吐絮鈴的總籽棉重/20）、平均單鈴皮棉重（隨機取的20個中部吐絮鈴的總皮棉重/20）、衣分（皮棉重量占單位籽棉重量的百分比）；每個株系取自交的中部鈴，每份材料準備10 g 皮樣測定纖維品質(zhì)，測定包括上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、馬克隆值、斷裂比強度4個主要指標。

1.2.11數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。利用GraphPad Prism 7.00 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhFAD2-1基因的生物信息學分析

根據(jù)ExPASy-ProtParam 預(yù)測，GhFAD2-1 編碼385個氨基酸，分子量43.99 kD，等電點為8.87。運用TMHMM 預(yù)測FAD2-1的跨膜結(jié)構(gòu)域，它包含6個假定的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1），這與FAD2 屬于膜結(jié)合蛋白相印證[4]。用CDD 在線工具分析FAD2-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，分析表明，F(xiàn)AD2-1 是一類含有Delta12-FADS-like 保守結(jié)構(gòu)域的蛋白，屬于Membrane-FADS-like superfamily。

圖1 GhFAD2-1 跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.1 Prediction of GhFAD2-1 transmembrane domain

2.2 GhFAD2-1基因部分序列擴增與RNAi 載體構(gòu)建

在NCBI 上獲取陸地棉GhFAD2-1（Gen-Bank:HQ259410.1）的序列，設(shè)計特異性引物，PCR 擴增GhFAD2-1的保守片段FAD2-1，381 bp，TA 克隆，送單克隆測序，測序結(jié)果表明該片段與GhFAD2-1（GenBank:HQ259410.1）序列一致。序列比對結(jié)果如圖2。

合成BP 引物，以上步驟克隆得到的FAD2-1為模板進行PCR 反應(yīng)，得到帶有BP 接頭的FAD2-1 片段，利用Gateway 技術(shù)將帶有BP 接頭的FAD2-1 序列構(gòu)建入pHellsgate4（kan＋）干涉表達載體中，如圖3。載體連接成功后，再進行PCR驗證和雙酶切驗證，獲得GhFAD2-1 干涉載體。

圖2 FAD2-1 保守片段序列比對Fig.2 The alignment of FAD2-1 conservative sequence

圖3 GhFAD2-1 干涉載體構(gòu)建示意圖Fig.3 Schematic diagram of GhFAD2-1 interference vector construction

2.3 T0 植株陽性鑒定

將GhFAD2-1 干涉載體在棉花上進行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得GhFAD2-1的T0轉(zhuǎn)基因陽性植株16 株，提取轉(zhuǎn)基因T0植株的DNA，進行PCR 陽性檢測，選擇后續(xù)試驗有穩(wěn)定表型的兩個株系FAD-5 和FAD-11 進行展示（圖4），A 為標記基因NPTⅡ鑒定結(jié)果，B 為目的基因鑒定結(jié)果。

圖4 T0 轉(zhuǎn)基因植株陽性檢測Fig.4 Positive detection of T0 generation

2.4 轉(zhuǎn)基因植株T4 Southern 雜交

選取部分T4植株，以陽性鑒定擴增的NPT-Ⅱ基因部分序列為探針，檢測轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)。Southern Blot 結(jié)果如圖5，F(xiàn)AD-5 為2個拷貝，F(xiàn)AD-11 為3個拷貝。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株T4 Southern BlotFig.5 Southern Blot of transgenic plants of T4 generation

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的基因表達量檢測

取T4轉(zhuǎn)基因植株的30 d 胚珠，于液氮中研磨成粉末，提取RNA，測定濃度與質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測Gh-FAD2-1的表達量（圖6）。FAD-5 與野生型植株（Wild Type,WT）相比，F(xiàn)AD-11 與陰性對照植株（Null，F(xiàn)AD-11 轉(zhuǎn)基因株系分離的陰性植株）相比，GhFAD2-1基因在胚珠中的表達量顯著低于對照（P＜0.01）（后續(xù)野生型植株稱為對照1（CK1）；FAD-11的陰性對照植株稱為對照2（CK2）。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株表達量Fig.6 Relative expression level of transgenic plants

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的脂肪酸組分測定

利用GC-MS 測定轉(zhuǎn)基因株系FAD-5、FAD-11的T2、T3、T4成熟種子的脂肪酸含量，以各個脂肪酸占所有脂肪酸的百分比來表示。結(jié)果如表1，轉(zhuǎn)基因株系FAD-5 與CK1 相比油酸提高25.63 ～40.74 百分點、亞油酸含量降低21.56～36.27 百分點，F(xiàn)AD-11 與CK2 相比油酸含量升高20.9～29.11 百分點，亞油酸含量降低17.67～25.98 百分點。在高世代（T4）種植于武漢（W）地區(qū)的轉(zhuǎn)基因株系FAD-5 將油酸從18.18%提高到58.92%，提高了224.1%，將亞油酸從51.54%降低到15.27%，降低了237.5%。種植于鄂州（E）的轉(zhuǎn)基因植株與武漢具有相似的表型，說明轉(zhuǎn)基因植株高油酸低亞油酸表型較穩(wěn)定，基本不受環(huán)境的影響。綜上所述，F(xiàn)AD-5 和FAD-11與CK1 和CK2 相比油酸含量升高，亞油酸含量下降，并且能夠穩(wěn)定遺傳給下一代。

除了油酸與亞油酸的變化，棕櫚酸的變化也呈現(xiàn)了一定的規(guī)律，F(xiàn)AD-5 和FAD-11 與CK1 和CK2 相比棕櫚酸含量降低。在T3，F(xiàn)AD-5、FAD-11的棕櫚酸分別下降了2.98 百分點、2.70 百分點（P＜0.01）。種植于湖北武漢（W）和種植于鄂州（E）的T4，F(xiàn)AD-5、FAD-11的棕櫚酸含量均表現(xiàn)下降（P＜0.01）。這與前人的研究所得出的結(jié)論相似[6，11]。

表1 棉花種子脂肪酸相對含量Table 1 Relative content of fatty acids in cotton seeds %

2.7 轉(zhuǎn)基因植株百粒重及含油量的測定

T4轉(zhuǎn)基因植株的百粒重及含油量結(jié)果列于表2，材料分別種植于武漢（W）和鄂州（E）兩個地點。種植于武漢的FAD-5 株系種子含油量和百粒重比CK1 低（P＜0.01），F(xiàn)AD-11 含油量高于CK2、百粒重低于CK2（P＜0.01）。種植于鄂州的植株，F(xiàn)AD-5的含油量低于CK1（P＜0.01），但百粒重與CK1 差別不大；FAD-11的含油量及百粒重與CK2 相差不大。綜上，種植于不同地區(qū)的植株在百粒重及含油量方面沒有顯著的變化規(guī)律，這可能與百粒重及含油量受環(huán)境影響較大有關(guān)。

2.8 轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀考察

在棉花吐絮期對分別種植于武漢和鄂州的T4植株進行農(nóng)藝性狀考察，包括始果枝節(jié)位、果枝數(shù)、葉枝數(shù)、有效鈴數(shù)、株高、平均單鈴籽棉重、平均單鈴皮棉重、衣分，測量樣本為每個株系隨機選擇5 株長勢一致的植株。結(jié)果如表3，種植地點對植株的農(nóng)藝性狀有一定的影響，種植于鄂州的植株普遍比種植于武漢的植株高，始果枝節(jié)位大，單鈴籽棉與皮棉輕；但種植于同一地點的植株的整體水平基本一致。種植于武漢的FAD-5 和FAD-11 植株有效鈴數(shù)多于CK1和CK2，種植于鄂州的則相反，但差異未達顯著水平；整體來看，F(xiàn)AD-5 和FAD-11 與CK1 和CK2 相比，所考察的農(nóng)藝性狀沒有顯著的差異，說明在干涉目的基因的情況下不影響植株的農(nóng)藝性狀。

表2 轉(zhuǎn)基因植株種子性狀Table 2 Seed traits of transgenic plants

2.9 轉(zhuǎn)基因植株的纖維品質(zhì)

對分別種植于武漢（W）和鄂州（E）的T4轉(zhuǎn)基因植株進行纖維品質(zhì)測定。每個株系取自交的中部鈴，每份材料準備10 g 皮樣測定纖維品質(zhì)，測定包括上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、馬克隆值、斷裂比強度4個主要指標（表4），轉(zhuǎn)基因植株、陰性植株與WT 纖維屬于中短絨，整齊度較高，馬克隆值屬于C 級，斷裂比強度較低；轉(zhuǎn)基因植株FAD-5 和FAD-11 與CK1 和CK2 間無顯著性差異，說明在提高油酸含量、降低亞油酸含量的情況下，植株的纖維品質(zhì)不受影響。

3 討論

3.1 FAD2-1的沉默改變脂肪酸組成

△12-脂肪酸去飽和酶（FAD）是控制生物體內(nèi)油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，研究FAD2的表達模式及功能對調(diào)控油料作物油酸的積累具有重要的作用。本研究利用RNA 技術(shù)，使得轉(zhuǎn)基因棉花FAD2-1基因表達量下降，油酸大量積累，亞油酸大量減少，將油酸含量從18.18%提高到58.92%，亞油酸含量從51.54% 降低到15.27%；這與前人在擬南芥中的研究[12-13]基本一致。在提高種子油酸降低亞油酸含量的同時，硬脂酸含量基本不變；大部分植株的棕櫚酸含量下降，具體生化機理有待進一步研究。

表3 轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀Table 3 The agronomic traits of transgenic plants

表4 轉(zhuǎn)基因植株纖維品質(zhì)Table 4 Fiber quality of transgenic plants

3.2 轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锷砼c農(nóng)藝性狀的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD2的突變或沉默會影響植物的營養(yǎng)生長與生殖生長，如營養(yǎng)體生長緩慢、花蕾死亡、結(jié)實率低、不耐冷等[14]，使得產(chǎn)量變低；本研究中，改變了棉花體內(nèi)的脂肪酸組分比例，轉(zhuǎn)基因棉花生長過程中，未見營養(yǎng)生長與生殖生長發(fā)生明顯變化。在改善脂肪酸成分的同時，考察了GhFAD2-1 轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在干涉目的基因的情況下不影響棉花植株的農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)。至于不飽和脂肪酸組分改變與生物和非生物脅迫的關(guān)系值得進一步探索。

3.3 拷貝數(shù)問題

本研究利用Southern 雜交技術(shù)來鑒定轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，從結(jié)果來看，轉(zhuǎn)基因株系含2～3個拷貝，可能是由于侵染時菌液的濃度高、侵染的時間過長、共培養(yǎng)時間過長導致的。通常發(fā)生1～2個外源基因整合事件的植株是具有高表達水平的轉(zhuǎn)基因植株，整合拷貝較高會引起轉(zhuǎn)基因的低表達和不穩(wěn)定表達，甚至引起轉(zhuǎn)基因沉默[15]。本研究中，3個拷貝的FAD-11 株系的高油酸低亞油酸表型表現(xiàn)沒有2個拷貝的FAD-5 株系好，可能是由于整合拷貝數(shù)較多對外源基因的表達造成了影響，或者是外源基因在基因組中的整合方式影響了基因的表達。因此有必要將多拷貝轉(zhuǎn)基因品系與野生型受體進行雜交，分離出單拷貝品系，既有利于明確基因干涉的效應(yīng)，也有利于在育種中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究以陸地棉為模板克隆了GhFAD2-1基因保守序列，cDNA 序列全長381 bp，編碼127個氨基酸；構(gòu)建了GhFAD2-1基因的RNAi載體并利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法在棉花上進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了后代表型較好的2個株系，分別是2個拷貝的FAD-5 及3個拷貝的FAD-11。通過對GhFAD2-1 轉(zhuǎn)基因植株連續(xù)三代（T2～T4，T4多點種植）脂肪酸的測定，發(fā)現(xiàn)干涉GhFAD2-1 能夠有效改善棉籽油脂肪酸的組成并且能夠?qū)⒏哂退?、低亞油酸的表型穩(wěn)定遺傳給后代；轉(zhuǎn)基因株系可將棉花種子油酸提高224.1%，將亞油酸降低237.5%；同時轉(zhuǎn)基因未對植株的農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)產(chǎn)生明顯改變。本研究為培育高油酸棉花品種提供一定的幫助。