陸地棉TLP基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

張華崇，張文蔚，簡桂良*，李蔚

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2. 黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北黃岡438000）

植物與病原體協(xié)同進(jìn)化過程中，逐漸形成了一系列復(fù)雜高效的保護(hù)機(jī)制來抵御病原物的侵染。在抗病性產(chǎn)生過程中，植物常激活各種形式的防衛(wèi)反應(yīng)，其中就包括病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-related proteins，PR 蛋白）的產(chǎn)生和積累。PR 蛋白根據(jù)氨基酸組成、生物化學(xué)和血清學(xué)特性，分為17個(gè)家族[1]，其中PR5 蛋白，又稱類甜蛋白（Thaumatin-like proteins，TLP），包含1 段G-X-[GF]-X-C-X-T-[GA]-D-C-X-（1,2）-G-X-（2,3）-C的保守結(jié)構(gòu)域[2]。

TLP 是植物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有β-1,3-葡聚糖酶活性，參與多種植物病原真菌侵染后的防御反應(yīng)，如水稻紋枯病菌（Rhizocotonia solani）的侵染可誘導(dǎo)水稻TLP基因表達(dá)，增強(qiáng)了其對該病原菌的抗性[3-4]；超表達(dá)羅勒（Ocimum basilicum）ObTLP1基因明顯提高了擬南芥對核盤菌（Scleretonia sclerotiorum）和灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性[5]。轉(zhuǎn)入海島棉GbTLP1基因的煙草對黃萎病菌（Verticillium dahliae）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）有顯著的抗性[6]。此外，TLP 介導(dǎo)對多種非生物脅迫的耐受性，超表達(dá)TLP1基因可明顯提高擬南芥種子在鹽脅迫和氧脅迫下的萌發(fā)率[5,7]，也可以提高轉(zhuǎn)基因煙草對鹽脅迫和干旱脅迫耐受性[8]。

TLP屬于多基因家族，目前已分別從擬南芥和水稻的基因組和表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）數(shù)據(jù)庫中分離得到TLP家族基因28 和31個(gè)[9-10]，而棉花中TLP家族基因的數(shù)量還未見報(bào)道。為了全面了解陸地棉基因組中TLP家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能，本研究通過生物信息學(xué)方法利用陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫和陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 全基因組測序結(jié)果[11-12]，分析了陸地棉中TLP基因的數(shù)目、基因結(jié)構(gòu)、染色體位置、系統(tǒng)發(fā)育以及響應(yīng)棉花黃萎病菌侵染表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試棉花品種為耐病品種岡早1號（GZ-1）和感病品種86-1。2個(gè)品種種子用濃硫酸脫絨處理后，挑選飽滿、大小一致的滅菌，然后將其點(diǎn)播于花盆中（裝填營養(yǎng)土與蛭石的體積比為2∶1），放置于溫度24 ℃、16h 光照、8h 黑暗、相對濕度為70%的溫室生長，當(dāng)棉株長出真葉時(shí)，移至燒杯中，采用營養(yǎng)栽培法培養(yǎng)棉株[13]。2 片真葉完全展開時(shí)，采用蘸根法接種棉花黃萎病菌（強(qiáng)致病力大麗輪枝菌菌株V991），孢子懸浮液的含量為107mL-1，接種0、3、6、12、24、36 和48h 后分別取2個(gè)品種棉株幼根，液氮冷凍處理后保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 全基因組檢索鑒定TLP 基因

以Pfam（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫下載的基因種子文件Thaumatin（PF00314）為探針，用BLASTp 在Cottongen（https://www.cottongen.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索陸地棉TLP基因家族編碼的氨基酸序列，剔除冗余序列后，利用和SMART[14]（http://smart.embl-heidelberg.de）對所有候選的棉花TLP 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域鑒定，保留含有完整結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得棉花TLP基因家族。

1.3 理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過ExPASy 網(wǎng)站中的程序Protparam[15]（http://web.expasy.org/protparam/）對TLP 相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，同時(shí)利用在線網(wǎng)站Soft Berry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）中的PROTCOMP 程序?qū)LP 家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

1.4 棉花TLP 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用分子進(jìn)化分析軟件MEGA 5.2的Clustal W 程序?qū)﹁b定的陸地棉TLP 家族和10個(gè)擬南芥中典型TLP 進(jìn)行多重序列比對，采用鄰接法（NJ，neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000 次重復(fù)。

1.5 TLP 基因家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白序列保守模體（Motif）分析

通過在線工具GSDS2.0[16]（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析和繪制棉花TLP基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)圖。利用在線軟件MEME[17]（http://meme-suite.org/）對TLP 保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。模體最大發(fā)現(xiàn)數(shù)量設(shè)置為5，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.6 TLP 基因染色體定位分析

在Cottongen（https://www.cottongen.org/）數(shù)據(jù)庫中獲得的TLP基因序列及其編碼序列，利用MapInspect 進(jìn)行染色體定位作圖。

1.7 候選基因表達(dá)的定量分析

各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品RNA 提取參照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒說明書，利用Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）采用Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）試劑盒，以上試劑盒均購自TIANGEN 公司。反應(yīng)體系（20 μL）：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-free ddH2O 7.4 μL。兩步法反應(yīng)程序：94 ℃15 min；95 ℃10 s，60 ℃32 s，40個(gè)循環(huán)。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)候選基因的qRT-PCR 特異引物（表1），以陸地棉GhUBQ7（DQ116441）作為內(nèi)參基因。在ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行，采用2-ΔΔCT 計(jì)算候選基因相對表達(dá)量[18]，采用Origin 8軟件對候選基因的定量結(jié)果進(jìn)行柱形圖分析。

表1 熒光定量PCR 引物Table 1 Primer sequences used in qPCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花TLP 家族鑒定

利用結(jié)構(gòu)域預(yù)測得到的結(jié)構(gòu)域信息（PF00314），對陸地棉全基因組搜索，剔除冗余序列后，發(fā)現(xiàn)陸地棉有88個(gè)具有典型完整TNH 結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員（表2）。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，最長的蛋白質(zhì)序列為Gohir.A11G164600，包含817個(gè)氨基酸殘基，最短的蛋白質(zhì)序列為Gohir.D02G093800，包含200個(gè)氨基酸殘基。相對分子質(zhì)量最大的蛋白質(zhì)序列為Gohir.A11G164600（90 274.52 Da），相對分子質(zhì)量最小的序列為Gohir.D02G093800（20 580.13 Da）。理論等電點(diǎn)差異較大：Gohir.D11G002900 最大，為9.31；Gohir.D01G097200 最小，為4.34。亞細(xì)胞定位顯示，大多數(shù)TLP 定位在胞外，少數(shù)蛋白定位在液泡，僅Gohir.A11G164600 定位在細(xì)胞質(zhì)膜。

2.2 TLP 家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）顯示，88個(gè)棉花TLP 與來源于擬南芥的10個(gè)TLP 共聚成11類。其中：基于擬南芥的10個(gè)TLP分別聚成10類，這與前人研究結(jié)果[19-20]類似，來源于陸地棉的TLP 在10類中都有分布；另外6個(gè)陸地棉的TLP（Gohir.D09G140300、Gohir.A09G144500、Gohir.A04-G069700 、Gohir . D04G108100 、Gohir . D04G-108300 和Gohir.D04G108200）單獨(dú)聚類，來源于同源染色體A 亞組和D 亞組的TLP 蛋白有聚于同一分支的趨勢。其中聚類6 TLP 最多，包含19個(gè)陸地棉TLP。有研究顯示，聚類5 中TLP 具有抑菌活性，能提高植物對病原真菌抗性[5]，推測位于聚類5的陸地棉TLP 也參與植物的抗病反應(yīng)。

2.3 TLP 基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白序列的保守模體分析

為了解TLP基因家族基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用GSDS 構(gòu)建了陸地棉TLP基因家族基因結(jié)構(gòu)，比較了TLP基因的內(nèi)含子和外顯子（圖2）。分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉中的TLP基因長度變化很大，在723～2 243 bp，TLP 基因家族外顯子數(shù)量介于1～5 之間，內(nèi)含子介于0～4 之間，同一聚類內(nèi)存在相似的外顯子、內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)，也進(jìn)一步證實(shí)了系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。利用在線程序MEME 對陸地棉TLP 家族保守模體分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TLP 家族含有5個(gè)保守的motif（圖3），其長度不等，介于15～31個(gè)氨基酸殘基；其結(jié)構(gòu)域高度保守，除了Gohir.D12G228600，其他TLP 家族都還有完整的5個(gè)motif，且具有相同的模體組織模式，均為Motif 5_4_2_3_1。

表2 陸地棉TLP 家族信息Table 2 Information of TLP family identified in Gossypium hirsutum

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

圖1 陸地棉中TLP 家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of the TLP sequences in G. hirsutum

圖2 陸地棉TLP 家族基因結(jié)構(gòu)Fig. 2 Gene structure of the TLP family in G. hirsutum

圖3 陸地棉TLP 家族保守模體分析Fig. 3 Conservation motif analysis of TLP protein family in G. hirsutum

2.4 陸地棉TLP 基因家族染色體定位

根據(jù)基因位置信息，利用MapInspect 繪制了基因的染色體定位圖（圖4），除了Gohir.1Z057000，其余87個(gè)TLP基因定位于陸地棉20條染色體上，其中A 亞組分布有42個(gè)TLP家族基因，且在A12染色體上分布最多，有8個(gè)TLP家族基因；D 亞組分布有45個(gè)TLP家族基因，且在D5 和D12染色體上分布最多，各有7個(gè)TLP家族基因。此外，TLP基因在染色體上的分布存在大量串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，例如A 亞組中A12染色體的上Gohir.A12G226100 和Gohir.A12G226200，DA 亞組中A12染色體的上Gohir.D04G108100和Gohir.D04G107900，這表明陸地棉TLP基因在染色體上并不是隨機(jī)分布的。

2.5 候選基因響應(yīng)棉花黃萎病菌侵染表達(dá)分析

qRT-PCR 分析結(jié)果（圖5）顯示，黃萎病菌侵染可以誘導(dǎo)6個(gè)候選基因的表達(dá)，在抗病性不同的2個(gè)棉花品種中相對表達(dá)量達(dá)到峰值的時(shí)間不同，且基因表達(dá)量在耐病品種中比在感病品種中有增高的趨勢。對于耐病品種GZ-1，其在接種黃萎病菌6～24h 后基因的相對表達(dá)量達(dá)到峰值；而對于感病品種86-1，其在接種黃萎病菌6～36h 后基因的相對表達(dá)量達(dá)到峰值。因此，這些基因可能與陸地棉抗病性相關(guān)，參與陸地棉對黃萎病菌的應(yīng)答和信號傳導(dǎo)等。

圖4 陸地棉TLP 家族基因染色體定位Fig. 4 Chromosome location of TLP family gene in G. hirsutum

3 討論與結(jié)論

隨著大量物種基因組測序結(jié)果的釋放，在基因組水平上獲得基因家族的序列、結(jié)構(gòu)和比較不同物種之間同源基因的進(jìn)化關(guān)系成為可能。本研究根據(jù)釋放的陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，利用BLASTp 檢索篩選出88個(gè)編碼典型完整TNH結(jié)構(gòu)域的TLP 氨基酸序列；利用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸殘基在200～817個(gè)，相對分子質(zhì)量介于20 580.13～90 274.52 Da 之間，理論等電點(diǎn)介于4.34～9.31 之間；亞細(xì)胞定位顯示，大多數(shù)TLP 定位在胞外，少數(shù)蛋白定位在液泡。這與劉潮等[21]在桑樹上鑒定的TLP 亞細(xì)胞定位結(jié)果一致，TLP 可能在胞外發(fā)揮作用。

圖4 （續(xù)）Fig. 4 (Continued)

圖5 接種黃萎病菌后6個(gè)候選基因在抗病性不同的2個(gè)陸地棉品種中的相對表達(dá)量Fig. 5 Relative expression of six candidate genes in two upland cotton cultivars with different disease resistance after V. dahliae inoculation

TLP的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉中大部分TLP 家族能和來源于擬南芥中的10個(gè)典型TLP分別聚為10個(gè)類，來源于水稻的47個(gè)TLP也聚于10類，來源于辣椒的28個(gè)聚于8類TLP[22-23]，說明TLP 家族基因存在高度分化，這與該家族基因功能多樣性是一致。但有6個(gè)TLP 不在以上10類內(nèi)，這可能其分化形成在與擬南芥物種分化之后，有其特殊性。同一聚類內(nèi)各基因結(jié)構(gòu)和蛋白序列保守基序組織模式相似，這也說明系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

TLP基因家族染色體定位顯示，87個(gè)TLP基因定位于陸地棉20條染色體上，其中A 亞組和D 亞組各分布有42 和45個(gè)TLP家族基因，且在A12染色體上分布最多，有8個(gè)；TLP基因在染色體上的分布存在大量串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，以前研究[24-26]在全基因組鑒定棉花中FAR1/FHY3、HD-ZipⅣ和BZR基因家族都有串聯(lián)重復(fù)或者片段復(fù)制事件，這也是基因家族擴(kuò)增的主要方式[27]。

其他物種中，聚類5 蛋白與病原菌響應(yīng)有關(guān)[5]。植物TLP 蛋白主要通過裂解真菌孢子，抑制孢子萌發(fā)對病原真菌產(chǎn)生抑制作用[28-29]；TLP具有β-1,3-葡聚糖酶活性，能結(jié)合并降解真菌細(xì)胞壁[30-31]。本研究選取編碼聚類5 蛋白的6個(gè)候選基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種黃萎病菌后6個(gè)候選基因表達(dá)量都顯著升高，且在耐病品種GZ-1 中比感病品種86-1 中表達(dá)量更高。據(jù)此推測，6個(gè)候選基因在棉花介導(dǎo)抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。