棉屬D基因組3個(gè)野生棉種Bet v 1基因鑒定及功能分析

董琪，Magwanga Richard Odongo，路普，蔡小彥，周忠麗，王省芬，王星星，許艷超，侯宇清，王艷情，王坤波，劉方*，馬峙英*

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071001；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng)455000）

Bet v1基因家族以樺樹(shù)花粉過(guò)敏原Bet v 1命名[1]，屬于植物病程相關(guān)蛋白PR10[2]，在雙子葉植物中分布廣泛。病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）最初被描述為一類植物特異性蛋白質(zhì)，因病原體的感染而積累[3]。進(jìn)一步研究表明，多種生物和非生物脅迫能夠誘導(dǎo)PR 蛋白表達(dá)量升高[4-5]。PR10 是PR 蛋白中唯一的胞內(nèi)蛋白，不含信號(hào)肽[6]。多項(xiàng)研究表明，多數(shù)PR10 蛋白是受真菌誘導(dǎo)表達(dá)的胞內(nèi)多肽，能利用核糖核酸酶活性降解病原菌核酸殺死真菌[7]。Bufe等研究發(fā)現(xiàn)Bet v 1蛋白具有核糖核酸酶活性[8]，表明Bet v 1結(jié)構(gòu)域?qū)R10 蛋白的抗真菌活性至關(guān)重要。

X 射線衍射和核磁共振顯示Bet v 1蛋白結(jié)構(gòu)包含6個(gè)反向平行的β 折疊和3個(gè)α 螺旋[9]。Bet v 1蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)存在1個(gè)大疏水空腔[10]，這種特殊結(jié)構(gòu)使它有可能作為配體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用，與具有重要生物學(xué)功能的激素、生物大分子和活性物質(zhì)結(jié)合，調(diào)控Bet v 1蛋白在植物體內(nèi)的活性或含量，從而調(diào)節(jié)植物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性[1]。研究人員鑒定出許多具有Bet v 1結(jié)構(gòu)域的PR10 蛋白。張玉等利用底物法和濾紙片法研究證實(shí)煙草PR10 蛋白能夠有效抑制赤星病菌（Alternaria alternata）的活性[11]。煙草花葉病毒侵染辣椒后，辣椒CaPR-10 蛋白受到磷酸化修飾，分解入侵病毒RNA的核糖核酸酶活性顯著提高[12]。Liu等從牛茄子（Solanum surattense）中分離到SsPR10，未磷酸化的SsPR10 蛋白對(duì)牛茄子葉片總RNA 具有核糖核酸溶解活性，并能抑制稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）的菌絲生長(zhǎng)[13]。Xie等研究發(fā)現(xiàn)玉米ZMPR101 對(duì)丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）有較強(qiáng)的抑制作用[14]。Chadha等研究了花生AhPR10 對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抑制作用，表明AhPR10 蛋白具有體外抗真菌活性[15]。研究人員在海島棉（Gossypium barbadense，Pima90-53，四倍體）中篩選到屬于9種PR 蛋白的50個(gè)基因，其中屬于PR10的基因可被黃萎病菌顯著誘導(dǎo)，并可能參與水楊酸信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[16]，推測(cè)D 基因組野生棉Bet v1基因與棉花黃萎病抗性密切相關(guān)。

棉屬野生種由于環(huán)境差異和長(zhǎng)期自然選擇，形成豐富的遺傳多樣性，具有許多優(yōu)良性狀，如抗病蟲(chóng)、抗寒、耐干旱、耐鹽堿等[17]，成為可被棉花育種應(yīng)用的優(yōu)異種質(zhì)資源[18]，挖掘野生棉中的抗病基因資源應(yīng)用于分子育種對(duì)控制棉花黃萎病的發(fā)生不失為一種有效措施[18]。雷蒙德氏棉（G.raimondii，D5）是D 基因組中唯一完成全基因組測(cè)序的棉種，為黃萎病菌侵染D 基因組野生棉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行有參分析奠定基礎(chǔ)[19]。前人采用蘸根接種法對(duì)8種野生棉的黃萎病抗性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明戴維遜氏棉（G.davidsonii，D3-d）為感病棉種；索馬里棉（G.somalense，E2）、瑟伯氏棉（G.thurberi，D1）、異常 棉（G. anomalum，B1）、長(zhǎng) 萼 棉（G.longicalyx，F(xiàn)1）、旱地棉（G.aridum，D4）和澳洲棉（G. australe，C3）為抗 病棉種；三裂棉（G.trilobum，D8）為高抗棉種[20]。本研究利用D 基因組二倍體棉種雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉對(duì)響應(yīng)病菌處理的潛在抗病基因進(jìn)行深入挖掘。

雷蒙德氏棉全基因組測(cè)序的完成，為鑒定和發(fā)掘棉花D 基因組抗病基因，探究棉花抗病的分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持。植物Bet v 1家族成員具有的核酸酶活性能夠降解病原菌的遺傳物質(zhì)，達(dá)到增強(qiáng)植物抗病性的目的。Bet v1基因在野生棉中尚未開(kāi)展研究。本研究采用生物信息學(xué)手段在D 基因組中對(duì)Bet v1基因家族進(jìn)行鑒定、基因結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)發(fā)育分析等。結(jié)合本課題已發(fā)表的D 基因組野生棉抗病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉黃萎病脅迫下家族成員表達(dá)的比較分析，以期為野生棉抗病相關(guān)基因挖掘提供參考，為抗病分子育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 Bet v 1基因家族鑒定和序列分析

雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)下載自Phytozome（http://www.phytozome.net/）數(shù)據(jù)庫(kù)。從Pfam 32.0（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載Bet v 1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件（PF00407），以PF00407 為探針，利用HMMER（http://hmmer.janelia.org/）軟件搜索雷蒙德氏棉蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[21]，得到本家族候選成員。通過(guò)在線工具Pfam、CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cg）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）驗(yàn)證候選Bet v 1蛋白序列中存在的保守結(jié)構(gòu)域。將最終得到的家族成員進(jìn)行重新編號(hào)，利用工具ExPASy Server（http://web.expasy.org/computer_pi）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。

1.2 染色體定位和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

根據(jù)雷蒙德氏棉Bet v1 家族基因的ID，在棉花功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CottonFGD（https://cottonfgd.org/）進(jìn)行搜索，確定Bet v1基因的染色體位置信息，利用軟件MapChart 2.2 繪制雷蒙德氏棉Bet v1基因的染色體定位圖。利用在線工具TargetP1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和Protein Prowler Subcellular Localization Predic tor version 1.2（http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/）進(jìn)行Bet v 1家族成員的的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，并通過(guò)WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育和基因結(jié)構(gòu)分析

為探究Bet v 1的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將鑒定的雷蒙德氏棉Bet v 1蛋白序列與分別來(lái)自Phyto zome（http://www.phytozome.net/）和TAIR（http://www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)的可可（Theobromacacao）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的Bet v 1蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用ClustalW 對(duì)可可、擬南芥和雷蒙德氏棉的Bet v 1蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEGA6.0 軟件通過(guò)Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap=1 000。此外，通過(guò)基因組序列及編碼序列，利用Gene Structure Displayer Server（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）顯示Bet v1的基因結(jié)構(gòu)。使用MEME（http://meme.sdsc.edu/meme/）鑒定雷蒙德氏棉Bet v 1蛋白的保守基序。

1.4 RNA-seq 分析3個(gè)棉種Bet v 1 家族基因的表達(dá)模式

本實(shí)驗(yàn)室前期完成對(duì)雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉（由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所野生棉課題組保存）的黃萎病抗性鑒定。在強(qiáng)致病性菌系臨西2-1的處理下，瑟伯氏棉抗病，三裂棉和雷蒙德氏棉感病，其中雷蒙德氏棉病情指數(shù)（Disease index，DI）最低。隨后完成了3個(gè)棉種1 片真葉期經(jīng)黃萎病菌處理0 h（接種相同體積PDA 培養(yǎng)基的對(duì)照組）、12h 和48h 根、莖和葉材料的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[22]，以雷蒙德氏棉基因組為參考基因組，獲得經(jīng)黃萎病菌處理的3個(gè)D 基因組棉種的RNA-seq 數(shù)據(jù)。本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得3個(gè)棉種中Bet v1基因的FPKM 值（Fragments per kilobases of transcriptper per million fragments mapped），經(jīng)log2FPKM 計(jì)算，利用TMeV 繪制熱圖。

1.5 棉花RNA 提取和基因表達(dá)分析

經(jīng)黃萎病菌處理一葉期的雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉，在0 h（接種相同體積PDA 培養(yǎng)液的對(duì)照組）、12h 和48 h分別取根、莖和葉組織樣品，速凍于液氮中。使用EASYspin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒RN38（Aidlab Biotechnologies Co.，Ltd，Beijing，China）提取樣品RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)每個(gè)RNA 樣品的質(zhì)量[23]。所有樣品均取0.5 μg RNA，使用TranScript-All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech Inc.，Beijing，China）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA合成。利用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)Bet v1基因的特異引物（表1），以Gractin7（F：5'-ATCCTC-CGTCTA GACCTTG-3'；R：5'-TGTCCATCAGGCAACTCAT-3'）作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析，按照2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品具有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。

表1 棉花Bet v 1基因qRT-PCR 分析的引物Table 1 Primers used in qRT-PCR analysis of the Bet v 1 genes in cotton

1.6 陸地棉Bet v 1基因功能驗(yàn)證

本研究通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）體系干擾陸地棉Gh_D04G1399 基因表達(dá)。利用特異性引物（F：5'-GGAATTCCTCAGGCAGTCAAGAGCGT-3'；R：5'-CGGATCCGGGGTTAGCCAAGAGGTAA-3'）克隆基因359 bp 長(zhǎng)的片段，通過(guò)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)插入煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）載體pTRV2 中，構(gòu)建35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pTRV:Gh_D04G1399 重組載體，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞，以含有pTRV1 載體的LBA4404 菌液作為輔助菌。待棉花（晉棉20）幼苗子葉展開(kāi)，真葉未長(zhǎng)出時(shí)，通過(guò)注射法侵染棉花幼苗子葉，以pTRV:PDS（八氫番茄紅素脫氫酶基因）棉株作為陽(yáng)性對(duì)照，未注射及注射空載體pTRV:00的棉株作為陰性對(duì)照。處理后的棉苗在24 ℃條件下黑暗處理24h 后，置于相對(duì)濕度大于60%、光周期為16h 光照/8 h黑暗的培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。

pTRV:PDS 棉株葉片白化3 d 后，對(duì)pTRV:Gh_D04G1399、pTRV:00和野生型（Wild type，WT）進(jìn)行黃萎病菌處理[24]。每株棉苗均勻傷根，缽底定量注射8 mL 孢子懸浮液（孢子含量1.2×107mL-1）。對(duì)照組接種相同體積的培養(yǎng)液。完成接種24h 后取樣，以Ghactin7（F：5'-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3'；R：5'-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3'）作為內(nèi)參基因，利用TRV1 引物（F：5'-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3'；R：5'-CCGGGTTCAATTC CTTATC-3'），TRV2 引物（F：5'-TGTTTGAGGGAAAAGTAGAGAACGT-3'；R：5'-TTACCGATC AATCAAGATCAGTCGA-3'）和Gh_D04G1399 引 物（F：5'-CTCAGGCAGTCAA GAGCGTT-3'；R：5'-ATGTCCTCCAATCTGGTGCT-3'）進(jìn)行半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Semi-qRT-PCR，SqRT-PCR），通過(guò)條帶密度檢測(cè)基因的擴(kuò)增效率。以Ghactin7 為內(nèi)參基因，利用Gh_D04G1399 引物進(jìn)行qRT-PCR，用于目的基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。接種黃萎病菌后15 d 和20 d時(shí)對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行記錄，并根據(jù)公式計(jì)算病情指數(shù)（Disease index，DI）：DI＝100×[∑（i×Ni）]/（4×N）。式中，i代表病級(jí)（0～4），Ni為i級(jí)幼苗數(shù)，N為幼苗總數(shù)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷蒙德氏棉Bet v 1基因鑒定和序列結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)HMMER 搜索獲得的候選氨基酸序列，剔除不含Bet v 1的冗余序列，最終獲得59條序列。按其在染色體上的位置分布，依次命名為Bet v1-1～Bet v1-59。氨基酸序列理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）表明：蛋白序列長(zhǎng)度范圍在66（Bet v 1-18）～204個(gè)（Bet v 1-37）氨基酸殘基（aa），主要集中在122～178 aa，占89.8%（53個(gè)）。蛋白質(zhì)的總平均親水性（GRAVY）值范圍為-0.562（Bet v 1-27）～0.333（Bet v 1-5），除Bet v 1-2、Bet v 1-5、Bet v 1-18、Bet v 1-23、Bet v 1-35 和Bet v 1-46外，其余53個(gè)蛋白質(zhì)的GRAVY 值均為負(fù)數(shù)，表明多數(shù)家族成員為親水性蛋白。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍為7.064（Bet v 1-18）～23.221 kDa（Bet v 1-37），理論等電點(diǎn)范圍為4.232（Bet v 1-5）～9.146（Bet v 1-37）。除基因Bet v1-5 和Bet v1-18外，其他Bet v1基因均含有內(nèi)含子（表2、圖1）。其中50個(gè)（84.7%）基因只含有1個(gè)內(nèi)含子，6個(gè)（10.2%）基因含有2個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子數(shù)目最多的基因?yàn)锽et v1-8（3個(gè)）。蛋白質(zhì)基序分析顯示，Bet v 1蛋白質(zhì)可分為3組（圖2）：第1組蛋白數(shù)量最多，基序包含motif 1、motif 2、motif 3、motif 4和motif 6；第2組包含motif2、motif5、motif6、motif7 和motif10；第3組則包括motif 6、motif 8和motif 9。結(jié)果表明，所有Bet v 1蛋白中較為保守的基序?yàn)閙otif 1、motif 2 和motif 6（圖2）。

圖1 雷蒙德氏棉Bet v 1基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和基因結(jié)構(gòu)Fig. 1 Phylogenetic tree and gene structure of the Bet v 1 genes in G. raimondii

表2 雷蒙德氏棉基因組Bet v 1基因及其編碼序列信息、理化性質(zhì)Table 2 Sequence information and physicochemical properties of Bet v 1 genes in the genomes of G. raimondii

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

圖2 雷蒙德氏棉Bet v 1蛋白保守基序預(yù)測(cè)Fig. 2 The prediction of conserved motifs of Bet v 1 proteins in G. raimondii

2.2 Bet v 1基因染色體和亞細(xì)胞定位

染色體定位分析顯示，除4個(gè)基因（Bet v1-56、Bet v1-57、Bet v1-58 和Bet v1-59）定位于scaffold 外，其余55個(gè)Bet v1基因分布在二倍體（D5）棉花基因組13條染色體中的8條（圖3）。染色體D501（Bet v1-1）與D507（Bet v1-34）上各有1個(gè)Bet v1基因，D503 上有2個(gè)基因（Bet v1-9和Bet v1-10），染色體D509 和D512 上各有3個(gè)基因，D502 上有6個(gè)基因，此外染色體D505 和D511 上帶有較多基因，各含有23個(gè)和15個(gè)。對(duì)Bet v 1 家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)占78.0%（46個(gè)），葉綠體、細(xì)胞骨架、胞外細(xì)胞器和細(xì)胞核各定位到4、3、3 和2個(gè)蛋白質(zhì)，有1個(gè)蛋白質(zhì)（Bet v 1-30）位于過(guò)氧化物酶體（表3），結(jié)果表明細(xì)胞質(zhì)和葉綠體可能是Bet v 1蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要場(chǎng)所。

圖3 雷蒙德氏棉Bet v 1基因在染色體上的位置Fig.3 The chromosome location of the Bet v 1 genes in G. raimondii

2.3 Bet v 1家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究雷蒙德氏棉Bet v1 家族的起源進(jìn)化關(guān)系，本研究構(gòu)建了雷蒙德氏棉、擬南芥和可可Bet v 1家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。將來(lái)自3個(gè)物種的Bet v 1蛋白質(zhì)分為5個(gè)組（Group1～Group5），成員最多的為第5組，所有的擬南芥Bet v 1蛋白均聚于此組。第2組中的Bet v 1蛋白均來(lái)自雷蒙德氏棉。Bet v 1蛋白質(zhì)顯示的聚類模式表明雷蒙德氏棉中的家族成員在自然界中具有一定的保守性。在整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中只檢測(cè)到1個(gè)同源基因?qū)Γ吹?組的雷蒙氏棉和可可間基因Gorai.012G128600（Bet v1-53）和Thecc1EG008111，且第1組中2個(gè)物種Bet v 1蛋白表現(xiàn)出較高的相似性，顯示了棉花與可可較近的親緣關(guān)系。

表3 雷蒙德氏棉Bet v 1基因染色體和亞細(xì)胞定位Table 3 Chromosome and subcellular localization of the Bet v 1 genes in G. raimondii

表3 （續(xù)）Table 3 (Continued)

表3 （續(xù)）Table 3 (Continued)

圖4 雷蒙德氏棉、擬南芥和可可Bet v 1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of Bet v 1 proteins from G. raimondii, A. thaliana and T. cacao

2.4 3個(gè)棉種Bet v 1基因的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步了解Bet v1 在增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病抗性方面的潛在作用，利用課題前期完成的黃萎病菌脅迫下3個(gè)D 基因組野生棉雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。雷蒙德氏棉中共有45個(gè)Bet v1基因存在差異表達(dá)（圖5）。根據(jù)基因表達(dá)模式將雷蒙德氏棉Bet v1 家族基因分為3組。其中第1組的10個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；第2組基因數(shù)量最多，共22個(gè)，該組基因表達(dá)差異較小，如Bet v1-11（Gorai.005G062500）除在葉片中輕微下調(diào)表達(dá)，在根和莖中未見(jiàn)明顯的差異表達(dá)；第3組中的13個(gè)基因高度上調(diào)表達(dá)，如Bet v1-27（Gorai.005G156800）和Bet v1-54（Gorai.012G129000）在根、莖、葉中均高度上調(diào)表達(dá)（圖5A）。依據(jù)參考基因組，三裂棉和瑟伯氏棉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中分別鑒定到44 和45個(gè)Bet v1基因。2個(gè)棉種的表達(dá)譜具有與雷蒙德氏棉相似的基因表達(dá)模式，同樣可分為3組。第3組均高度上調(diào)表達(dá)（圖5B和圖 5C），如三裂棉中Bet v1-6（Gorai.002G177600）、Bet v1-54（Gorai.012G129000）和Bet v1-55（Gorai.012G135200），瑟伯氏棉中Bet v1-6（Gorai.002G177600）和Bet v1-54（Gorai.012G129000），在根、莖和葉組織均優(yōu)勢(shì)表達(dá)。

圖5 黃萎病菌脅迫下Bet v 1基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量熱圖Fig. 5 Heatmap of transcriptome expression of Bet v 1 gene under the stress of V. dahliae

為驗(yàn)證RNA-seqBet v1基因表達(dá)模式中第3組基因表達(dá)量的準(zhǔn)確性，本研究從中篩選13個(gè)Bet v1基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證（圖6）。與提供參考基因組的雷蒙德氏棉相比，黃萎病菌在三裂棉和瑟伯氏棉中誘導(dǎo)更多Bet v1基因上調(diào)表達(dá)，例如Bet v1-6（Gorai.002G177600）、Bet v1-28（Gorai.005G160700）和Bet v1-27（Gorai.005G156800）分別在雷蒙德氏棉根、莖和葉中下調(diào)表達(dá)，而在三裂棉和瑟伯氏棉的不同組織中均上調(diào)表達(dá)。本研究在3個(gè)棉種的qRT-PCR 分析中發(fā)現(xiàn)基因Bet v1-54（Gorai.012G129000）在不同組織樣品中均表現(xiàn)高度上調(diào)表達(dá)，qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)量與3個(gè)棉種的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平一致，推斷該基因在棉花抗黃萎病中發(fā)揮重要功能。

圖6 黃萎病菌脅迫下Bet v 1基因qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)量熱圖Fig. 6 Heatmap of qRT-PCR relative expression of Bet v 1 gene under the stress of V. dahliae

2.5 陸地棉Bet v 1基因VIGS 功能驗(yàn)證

通過(guò)TRV 誘導(dǎo)沉默陸地棉（晉棉20）中Bet v1-54（Gorai.012G129000）的同源基因Gh_D04G1399（相似性99.58%，圖7）。注射TRV:PDS菌液的陽(yáng)性對(duì)照植株2 周后新葉出現(xiàn)白化表型（圖7A），表明TRV 能夠有效沉默植株中的靶基因。通過(guò)SqRT-PCR 驗(yàn)證目的基因Gh_D04G1399的沉默效果（ 圖 7B），發(fā)現(xiàn)沉默（TRV:Gh_D04G1399）植株與野生型（WT）、陰性對(duì)照（TRV:00）相比，目的基因經(jīng)SqRT-PCR 后條帶亮度較弱。此外，利用qRT-PCR 檢測(cè)野生型、陰性對(duì)照和沉默植株中目的基因Gh_D04G1399的表達(dá)水平（圖7D）?？瞻讓?duì)照組（CK）中，沉默植株的目的基因表達(dá)水平分別是野生型和陰性對(duì)照的24.6%和21.9%；黃萎病菌處理后，目的基因高度上調(diào)表達(dá)，但沉默植株目的基因的表達(dá)同樣受到有效抑制（野生型的35.2%，陰性對(duì)照的36.1%）。表明目的基因Gh_D04G1399 被有效沉默。觀察棉株的表型特征，對(duì)照組中陰性對(duì)照和野生型植株沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)差異（圖7C），表明未插入靶基因的TRV 對(duì)植株的正常生長(zhǎng)沒(méi)有影響。黃萎病菌處理后，野生型和陰性對(duì)照植株變化差異較小，但沉默植株發(fā)病嚴(yán)重，葉片失綠嚴(yán)重，出現(xiàn)枯萎（圖7C）。病情調(diào)查結(jié)果（圖7E）顯示：沉默植株的病情指數(shù)（15 d 為25.8，20 d 為40.8）顯著高于陰性對(duì)照（15 d 為11.1，20 d 為15），目的基因的沉默嚴(yán)重影響棉株對(duì)黃萎病菌的抵抗能力，表明Gh_D04G1399 具有提高棉花黃萎病抗性的功能。

圖7 VIGS 分析黃萎病脅迫下棉花Gh_D04G1399 基因功能分析Fig. 7 Function analysis of Gh_D04G1399 in cotton by VIGS under Verticillium wilt stress

3 討論

黃萎病嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，棉花野生資源具有較強(qiáng)的抗病特性，研究其抗病性并從中挖掘抗病相關(guān)基因，對(duì)培育高抗黃萎病的棉花品種具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)野生棉種雷蒙德氏棉（D5）進(jìn)行基因組分析，從中鑒定出59個(gè)Bet v1基因。多數(shù)Bet v1基因含有內(nèi)含子。高等植物中內(nèi)含子的可變剪輯能夠調(diào)節(jié)基因的時(shí)空表達(dá)，此外還會(huì)影響基因表達(dá)的啟動(dòng)、基因的表達(dá)模式和表達(dá)水平的增強(qiáng)等[25]。因此，大多數(shù)脅迫響應(yīng)基因都具有內(nèi)含子，例如棉花MATE基因、CDK基因和LEA基因[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)Bet v1基因分布于D 基因組13條染色體中的8條。棉花簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）的研究中，在染色體上一般沒(méi)有明確的分布模式，極少表現(xiàn)為平均分布[29]。通過(guò)研究Bet v1基因在D 基因組染色體的分布，推測(cè)Bet v1基因與染色體可能具有特異的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

本課題前期完成了雷蒙德氏棉（感病，DI：55.00）、三裂棉（感病，DI：40.83）和瑟伯氏棉（抗病，DI：15.00）的室內(nèi)黃萎病抗性鑒定。黃萎病菌脅迫下3個(gè)棉種的Bet v1基因表達(dá)趨勢(shì)與其抗病水平一致，推測(cè)此類基因在增強(qiáng)棉花的黃萎病抗性方面起到了關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)Bet v1基因的表達(dá)水平，將其分成3組。第1組和第2組基因在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量較低，推測(cè)該部分基因不被黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)，在棉花抗病過(guò)程中作用較小。第3組基因在轉(zhuǎn)錄組分析中顯示高表達(dá)，其中三裂棉屬于第3組基因數(shù)量最多，瑟伯氏棉屬于第3組基因的表達(dá)量更高，暗示不同棉種中Bet v1基因間的差異導(dǎo)致其在生物脅迫中的效用發(fā)生變化。經(jīng)qRT-PCR 驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)水平與3個(gè)棉種對(duì)黃萎病的抗病水平一致，進(jìn)一步說(shuō)明瑟伯氏棉的對(duì)黃萎病的抗性較強(qiáng)。結(jié)合RNA-seq 和qRT-PCR 分析顯示基因Bet v1-54（Gorai.012G129000）在3個(gè)棉種中高度上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因在棉花抗黃萎病中發(fā)揮重要作用。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Bet v 1-54 定位于葉綠體。已知高等植物葉綠體在生物脅迫中的作用已被廣泛研究，許多生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)存在于葉綠體中，如Belhaj等證明葉綠體蛋白R(shí)PH1 能夠顯著增強(qiáng)擬南芥對(duì)油菜疫霉（Phytophthora brassicae）的抗性[30]。Zhao等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中葉綠體靶向蛋白DnaJ 過(guò)表達(dá)賦予了煙草耐旱性和對(duì)青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）的抗性[31]。通過(guò)VIGS 技術(shù)對(duì)Gh_D04G1399 基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)基因沉默植株黃萎病發(fā)病更嚴(yán)重，表明其表達(dá)限制黃萎病菌的侵染。根據(jù)研究者關(guān)于PR10 蛋白的研究，推測(cè)Bet v1基因受JA/SA 信號(hào)通路的調(diào)控，以磷酸化/去磷酸化為反應(yīng)開(kāi)關(guān)，通過(guò)核酸酶活性降解病原菌核酸，從而增強(qiáng)棉花的抗病性[32]。

4 結(jié)論

野生棉種中具有提高棉花生物脅迫和非生物脅迫耐受性的潛在基因資源，利用這些野生種質(zhì)，有助于突破遺傳基礎(chǔ)狹窄、遺傳多樣性喪失在現(xiàn)代棉花育種中的限制。本研究在雷蒙德氏棉D(zhuǎn)5基因組中鑒定到59個(gè)Bet v1基因，分布于8條染色體，78%的Bet v 1蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)，96.6%的基因具有內(nèi)含子，利用系統(tǒng)發(fā)育分析將這些基因分為5組。黃萎病菌脅迫下，雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉中基因表達(dá)水平與其抗病趨勢(shì)一致，根據(jù)表達(dá)水平將Bet v1基因分為3組，其中第3組基因響應(yīng)生物脅迫高量表達(dá)。Bet v1-54 在不同組織樣品中均優(yōu)勢(shì)表達(dá)。與陰性對(duì)照相比，VIGS 沉默Gh_D04G1399 基因的棉株發(fā)病更重，表明響應(yīng)黃萎病菌侵染的Bet v1家族基因可能具有增強(qiáng)棉花耐黃萎病的特性。本研究對(duì)發(fā)掘野生棉種的潛在抗病資源及棉花抗病遺傳改良具有參考價(jià)值。