柴黃清胰活血顆粒質(zhì)量控制*

趙 劍，李 志，李 靜，羅 群，李能源

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

柴黃清胰活血顆粒是西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科協(xié)定處方，由生大黃、柴胡、延胡索、梔子、黃芩、黃芪等14味中藥組方，具有清熱解毒、活血消腫、通腑泄熱、理氣止痛的功效，用于治療急性胰腺炎。前期研究中已確定了柴黃清胰活血顆粒的最佳提取工藝，為了進一步控制其質(zhì)量，根據(jù)處方中中藥所含化學成分的理化性質(zhì)，采用薄層色譜法對該制劑中的大黃、黃芪、黃芩、梔子、延胡索5味中藥進行定性鑒別［1］，采用高效液相色譜法同時測定處方中君藥大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，為制訂柴黃清胰活血顆粒的質(zhì)量標準提供試驗依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括SPD-20A型紫外可見檢測器LCsolution色譜工作站；JPGT0328型超聲提取器（武漢嘉鵬電子有限公司）；HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；薄層色譜硅膠G、硅膠G薄層板（青島海洋化工分廠）。

1.2 試藥

羧甲基纖維素鈉（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；藥用大黃對照藥材（批號為120984-201202），黃芪甲苷（批號為 110781-200613），黃芩苷（批號為 110715-201318），延胡素乙素（批號為 110726-201616），梔子苷（批號為110749-201309），蘆薈大黃素（批號為110795-201508），大黃酸（批號為 110757-200206），大黃素（批號為 110756-200110），大黃酚（批號為 110796-201621），大黃素甲醚（批號為110758-201415），均購于中國食品藥品檢定研究院；生大黃、柴胡、延胡索、丹參等14味中藥購于瀘州市寶光中藥飲片公司，經(jīng)瀘州市藥檢所中藥室袁常珍主任鑒定為正品，均符合2015年版《中國藥典》項下規(guī)定；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；怡寶純凈水；柴黃清胰活血顆粒（醫(yī)院制劑，批號分別為20170516，20170517，20170518）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

大黃：取本品10 g，加甲醇50 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖，提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制成不含大黃的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取大黃對照藥材0.3 g，加甲醇30 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502）試驗，取上述溶液各10 μL，分別點于以同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（6 ∶2 ∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果見圖1 A。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾［2-3］。

圖1 薄層色譜圖

黃芪：取本品10 g，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖，提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%NaOH溶液洗滌2次，每次20 mL，用正丁醇飽和的水洗至中性，分取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制成不含黃芪的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0502）試驗，將上述取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（20∶40∶22∶10，V/V/V/V）在10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，以105℃加熱至斑點顯色清晰。見圖1 B。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［4-5］。

梔子：取本品 10 g，加水20 mL使溶解，加乙醇30 mL，充分振搖，靜置30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖，提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇5 mL使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制成不含梔子的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取梔子苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0502）試驗，取上述溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 -甲醇（7∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖1 C。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［6-7］。

黃芩：取本品10 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH至2，用乙酸乙酯振搖，提取2次，每次30 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制成不含黃芩的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0502）試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一含4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液粘合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸 -水（5∶3∶1 ∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%FeCl3乙醇溶液。結果見圖1 D。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［8-9］。

延胡索：取本品 5 g，加甲醇 50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加濃氨調(diào)堿性（pH約為9），用乙醚提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制成不含延胡索的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502）試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷 -二氯甲烷 -甲醇（12∶8∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中3～5 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，在紫外燈（365 nm）下檢視。結果見圖1 E。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾［10-11］。

表1 方法學考察結果

圖2 高效液相色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（85 ∶15，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；柱溫：40℃。理論板數(shù)按各主峰計算均應不低于4000［12-16］。

2.2.2 溶液制備

取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，精密稱定，分別置相應容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為 0.076，0.098，0.116，0.068，0.082 g/L 的溶液，作為對照品貯備液。取本品10g，精密稱定，加甲醇50mL，浸泡1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖，提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方量并以相同工藝制備不含大黃的陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法制備，得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取對照品貯備液1 mL，置5 mL容量瓶中混合，加甲醇定容至刻度，搖勻，再分別量取混合液 1，3，6，10，13，16，20 μL 注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定，以峰面積（A）對進樣量（C）進行線性回歸，繪制標準曲線。結果見表1。

專屬性試驗：精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定。結果陰性對照品溶液中其他組分對測定無干擾，結果見圖2。

精密度試驗：精密吸取對照品混合溶液，連續(xù)進樣5 次，每次 10 μL，按 2.2.1 項下色譜條件測定峰面積。結果見表1，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h時進樣 10 μL，測定峰面積。結果見表 1，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20170516）6份，每份約10 g，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析。結果見表1，表明方法重復性好。

加樣回收試驗：取已知含量的柴黃清胰活血顆粒9份，每份約5 g，精密稱定，分別按其中所含各成分含量的50%，100%，150%加入相應對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣測定，計算回收率。結果見表2。

耐用性試驗：取樣品適量，依法制備供試品溶液，調(diào)整色譜條件為流速（0.8±0.2）mL/min，波長（254±2）nm，柱溫（40 ±5）℃，測定。結果見表 1，表明流速、波長、柱溫小的變動時耐用性合適，滿足系統(tǒng)適應性要求。

2.2.4 樣品含量測定

取 3批樣品（批號分別為 20170516，20170517，20170518），精密稱定，制備供試品溶液，利用外標法測定，計算。結果見表3。

3 討論

薄層色譜法是中藥鑒定的基本方法，也是快速分離和定性分析的一種重要技術手段。本試驗中對柴黃清胰活血顆粒處方中大黃、黃芪、黃芩、梔子、延胡索5味中藥進行薄層色譜鑒別。結果表明，系統(tǒng)專屬性強，色譜特征斑點清晰，分離良好，無拖尾現(xiàn)象，可作為柴黃清胰活血顆粒的定性鑒別標準。

因蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的極性均較小，考慮采用有機相比例較大的流動相，且這5種成分都含有酚羥基略顯酸性，故加入少量酸抑制拖尾現(xiàn)象。本試驗中分別考察0.1%，0.3%，0.6%磷酸及乙酸，結果選擇0.1%磷酸峰形良好，故選擇0.1%磷酸溶液作為無機相。同樣考察了有機相甲醇及乙腈，兩者都能較好地分離各成分，但甲醇比乙腈經(jīng)濟且毒性較小，故選甲醇為有機相。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）

表3 樣品含量測定結果（n=5）