高效液相色譜法測定羅漢松種子揮發(fā)油中川芎嗪含量*

林樂珍，趙凱麗，杜 坤，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧 530021）

羅漢松實為羅漢松科植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don 和短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki Endl.的種子和花托［1］。羅漢松實具有治心胃痛、血虛面色萎黃、大補元氣的功效［2］，主要含降二萜內(nèi)酯類及萜類化合物［3-6］、生物堿類化合物［7］、黃酮類化合物［8］及多糖類、氨基酸、礦物元素和維生素［9］等；其提取物具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、保肝和抗腫瘤等藥理作用［10-12］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)于北海的羅漢松種子揮發(fā)油中含有大量的川芎嗪，其在揮發(fā)油中的相對百分含量高達 97.27%［7］。本研究中建立了羅漢松種子揮發(fā)油中川芎嗪的含量測定方法，為建立羅漢松實藥材質(zhì)量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；電子天平，XS-205DU型天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，十萬分之一）；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CD-UPH-Ⅱ-20T型超純水器（成都超純科技有限公司）；萬能粉碎機（無錫久平儀器有限公司）。

1.2 試藥

羅漢松種子鮮品采自廣西北海，經(jīng)廣西醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室李瓊講師鑒定為羅漢松科植物短葉羅漢松P.macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki Endl.的種子；川芎嗪對照品（上海雅吉生物科技有限公司，批號為16072405）；甲醇為色譜純，磷酸、石油醚（30～60℃）和無水硫酸鈉均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取川芎嗪對照品約20 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.7572 g/L的對照品貯備液，精密移取2.0 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.06058 g/L的川芎嗪對照品溶液。取自然風干的羅漢松種子，粉碎，過20目篩，稱取100g置圓底燒瓶中，加入1000 mL蒸餾水浸泡12 h后，保持微沸蒸餾6 h。餾出液用石油醚萃取3次，每次50 mL，合并醚層，加入無水硫酸鈉脫水，50℃減壓回收溶劑，得有芳香氣味的淡黃色液體，即為揮發(fā)油；取揮發(fā)油約100 mg，精密稱定，加甲醇超聲溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇為陰性對照溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：GL Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（60 ∶40，V/V），等度洗脫；流速：0.8 mL/min；檢測波長：298 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。分別精密吸取 2.1 項下 3 種溶液進樣測定。在此色譜條件下，理論板數(shù)以川芎嗪峰計大于20000，分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品貯備液0.005，0.010，0.020，0.040，0.050，0.100，0.200，0.300 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻，定容，即得系列對照品溶液。按2.2項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以川芎嗪進樣質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、相對應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=82.182X+11.538，r=0.9998（n=8）。結(jié)果表明，川芎嗪進樣質(zhì)量濃度在0.38～22.72 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.1項下對照品溶液，按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定川芎嗪的峰面積。結(jié)果的RSD為0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取揮發(fā)油樣品6份，每份約100 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，并按2.2項下色譜條件進樣測定。結(jié)果川芎嗪平均含量為117.17 μg/g，RSD為1.60%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1項下供試品溶液，室溫放置0，2，4，8，12，24 h 時，按 2.2 項下色譜條件測定。結(jié)果的RSD為0.50%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量的揮發(fā)油6份，精密稱定，分別置容量瓶中，各精密加入一定質(zhì)量的川芎嗪對照品，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取羅漢松實揮發(fā)油3份，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣測定。結(jié)果 3 份樣品含量分別為 118.35，117.72，116.62 μg/g，平均 117.56 μg/g。

表1 川芎嗪加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

3 討論

本研究中采用水蒸氣蒸餾法對羅漢松種子進行提取，得淡黃色的揮發(fā)油，提取率為0.18%。在提取揮發(fā)油的過程中發(fā)現(xiàn)，將種子浸泡一段時間再蒸餾，可提高揮發(fā)油的提取率。考察了沸程為30～60℃和60～90℃石油醚對萃取效果的影響，結(jié)果2種石油醚的萃取效果相當。此外，萃取劑用量為被萃取液體積的1/2，萃取次數(shù)3次時，可獲得最佳萃取效果。

經(jīng)紫外掃描發(fā)現(xiàn)，川芎嗪在298 nm波長處有較強吸收，故選擇298 nm作為測定波長。在加樣回收試驗中，對照品的加入量對測定結(jié)果的準確性有影響。選擇川芎嗪含量較高的揮發(fā)油樣品，加入較大量的對照品，可獲得理想的測定結(jié)果。經(jīng)測定，產(chǎn)于北海的羅漢松種子揮發(fā)油中川芎嗪含量為117.56 μg/g，種子中川芎嗪的含量為 0.212 μg/g。

羅漢松種子中含有川芎嗪，而川芎嗪已廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和缺血性腦病的治療［13-14］，故建議將川芎嗪作為羅漢松實藥材質(zhì)量評價指標成分之一。本研究中建立了羅漢松種子中川芎嗪含量測定方法，操作簡單，結(jié)果準確，分離度和重復性均良好，可用于羅漢松實藥材的質(zhì)量控制。