二氧化硫?qū)λダ洗笫笱軆?nèi)皮功能的影響

劉瑞 趙瑾潔

衰老是由多種因素引起的復(fù)雜的、不可避免的生理過程。衰老作為心血管疾病的獨立危險因素，與高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。隨著年齡的增長，血管內(nèi)皮、血管壁及血管外膜發(fā)生結(jié)構(gòu)性和功能性的改變，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮功能障礙、血管壁增厚和細胞外基質(zhì)重塑等，從而導(dǎo)致血管硬化和血管張力增加[3，4]。其中，內(nèi)皮功能障礙被廣泛認為是導(dǎo)致血管老化的關(guān)鍵因素[5，6]。

與衰老相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙存在多種機制，包括一氧化氮（Nitric Oxide，NO）濃度的降低、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的增加、促炎性細胞因子的刺激及內(nèi)皮細胞的衰老等[7，8]。雖然血管老化的分子機制已經(jīng)得到了廣泛研究，但有效的治療方法仍然非常缺乏，目前的干預(yù)還是僅限于改善生活習(xí)慣，如在飲食上注意限制熱量的攝入及在生活中進行適度的運動等。隨著我國人口老齡化的不斷加重，對血管老化干預(yù)的研究具有十分重要的臨床意義。

二氧化硫（sulfur dioxide，SO2）是一種無色且具有刺激性臭味的有毒氣體，一開始人們對SO2的認識只停留在其毒性層面，近年來越多越多的研究表明，SO2不但可以內(nèi)源性的由機體內(nèi)含硫氨基酸氧化產(chǎn)生（如在心血管系統(tǒng)，半胱氨酸和同型半胱氨酸可以被天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AAT催化生成SO2），而且其在調(diào)節(jié)心率、維持血管舒張等過程中發(fā)揮著重要的生理作用[9，10]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，SO2參與了許多與血管疾病相關(guān)的病理生理過程，如可以減輕自發(fā)性高血壓大鼠和缺氧性肺動脈高壓大鼠模型中的血壓增加及血管重建[11]；可以下調(diào)TGF-β/Smad信號通路并減輕血管鈣化[12]，可以減弱Ang Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血管平滑肌細胞增殖等[13]。盡管已經(jīng)有大量文獻報道了SO2對心血管的各種保護作用，但其對血管衰老的作用，尤其是對衰老相關(guān)內(nèi)皮功能障礙的作用及其機制，目前還沒有得到充分研究。

本研究通過在D-半乳糖構(gòu)建的衰老動物模型上對血壓的變化、血管環(huán)舒張功能變化、氧化應(yīng)激損傷的改善情況等方面綜合探究SO2在衰老相關(guān)內(nèi)皮功能障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組8周大的健康雄性清潔級SD大鼠購于維通利華，在恒定的環(huán)境條件下飼養(yǎng)（12h光照/黑暗節(jié)律），環(huán)境溫度（22±1）℃，自由攝取食物和水。待大鼠適應(yīng)環(huán)境后將24只SD大鼠隨機分為對照組（Control組）、D-半乳糖組（D-gal組）、D-半乳糖+SO2組（D-gal+SO2組），各8只。D-半乳糖、D-半乳糖+SO2組大鼠連續(xù)3個月皮下注射D-半乳糖（150mg/kg），對照組大鼠給予等量生理鹽水。D-半乳糖+SO2組以亞硫酸鈉（Na2SO3）和亞硫酸氫鈉（NaHSO3）作為SO2供體（調(diào)整 Na2SO3和 NaHSO3的摩爾比為 3∶1，pH7.4），連續(xù)3個月腹腔注射85mg/kg劑量，對照組和D-半乳糖組大鼠在同一時間點腹腔注射等量生理鹽水。

1.2 血壓的測量3個月后，靜止?fàn)顟B(tài)下，采用尾袖法用BP-100A全自動無創(chuàng)血壓測量儀（成都泰盟）測量大鼠的收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均動脈壓（MAP）。各血壓的取值方法為去除離群值和過量噪音或動物活動后的讀數(shù)之后至少3次測量值的平均值。

1.3 大鼠主動脈環(huán)的制備及等長張力實驗3個月后，CO2窒息法處死大鼠，解剖分離出胸主動脈，清除結(jié)締組織后將主動脈切成3mm的血管環(huán)。然后按照通用的方法在這些分離出的胸主動脈環(huán)上評估血管舒張功能。即首先給予血管環(huán)一個2g前負荷的靜息張力，經(jīng)過60min平衡后，對動脈環(huán)進行苯腎上腺素（1μmol/L）預(yù)處理，待達到穩(wěn)定收縮后，以累加的方式添加乙酰膽堿（ACh，10-8～10-4mol/L），記錄內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)曲線。舒張反應(yīng)結(jié)果以占苯腎上腺素收縮值的百分比表示（%）。

1.4 活性氧及抗氧化酶活性的測定胸主動脈組織在液氮中研磨后，在50mmol/L磷酸鉀緩沖液中均質(zhì)，然后10 000g離心5min，根據(jù)試劑說明書，用相應(yīng)的檢測試劑盒（建成生物）測定上清液中過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）濃度及超氧化物歧化酶（SOD）活性，均通過蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化，使用BCA蛋白檢測試劑盒進行測定。

1.5 Western Blot檢測將胸主動脈蛋白抽提后用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，而后進行WB實驗，上樣量為60μg，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1h。而后一抗4℃孵育過夜：SOD1（1∶1000，Abcam）。洗膜液洗 3次后，2抗室溫孵育1h，顯影，利用Image J軟件對條帶灰度進行量化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，用±s表示，三組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SO2對衰老大鼠血壓的影響連續(xù)注射3個月后，與對照組相比，D-半乳糖組大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓較高（P＜0.05）；給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組衰老大鼠與D-半乳糖組大鼠相比，收縮壓、舒張壓和平均動脈壓較低（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠血壓的比較（±s，mmHg）

表1 三組大鼠血壓的比較（±s，mmHg）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 D-半乳糖組比較，△P＜0.05

血壓 對照組 D-半乳糖組 D-半乳糖+SO2組收縮壓 94.66±7.56 112.36±7.37* 100.94+7.31△舒張壓 77.50±5.26 91.62±7.11* 83.67±6.88△平均動脈壓 83.21±5.99 98.53±4.47* 89.43±6.95△

2.2 SO2對衰老大鼠胸主動脈環(huán)舒張功能的影響血管環(huán)張力實驗表明，D-半乳糖組大鼠胸主動脈環(huán)ACh誘導(dǎo)的舒張功能與對照組相比明顯受損，最大舒張率顯著下降[（65.90±8.90）%與（91.52±6.64）%，P＜0.05]；給予 SO2處理的 D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動脈環(huán)舒張功能與D-半乳糖組相比有了明顯改善，最大舒張率明顯升高[（84.96±7.79）%與（65.90±8.90）%，P＜0.05]，見圖1。

圖1 三組大鼠離體胸主動脈環(huán)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能變化

2.3 SO2拮抗D-半乳糖組衰老大鼠的氧化應(yīng)激損傷與對照組相比，D-半乳糖組衰老大鼠胸主動脈血管組織中的H2O2水平明顯較高（P＜0.05）；給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組與D-半乳糖組相比，衰老大鼠胸主動脈血管組織中的H2O2水平較明顯降低（P＜0.05），見表2。與對照組相比，D-半乳糖組衰老大鼠胸主動脈血管組織中的MDA水平明顯較高（P＜0.05）；給予 SO2處理可以明顯降低 D-半乳糖+SO2組衰老大鼠胸主動脈血管組織中的MDA水平（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠離體胸主動脈中H2O2及MDA含量比較（nmol/mg蛋白）

2.4 SO2對衰老大鼠胸主動脈血管組織中抗氧化酶SOD的含量及活性的影響D-半乳糖組大鼠胸主動脈血管組織中抗氧化酶SOD1的含量與對照組相比沒有明顯變化，SO2注射也不能改變組織中SOD1的含量，見圖2。

圖2 三組大鼠離體胸主動脈組織中SOD1蛋白表達的比較

隨著H2O2和MDA水平的升高，D-半乳糖組大鼠主動脈胸血管組織中抗氧化酶SOD的活性與對照組相比較低[（19.44±6.14）U/mg蛋白與（29.64±5.30）U/mg蛋白，P＜0.05]，但與 D-半乳糖組相比，SO2注射并不能提高D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動脈血管組織中抗氧化酶SOD的活性[（23.69±4.89）U/mg蛋白與（19.44±6.14）U/mg蛋白，P＞0.05]。

3 討論

衰老是一個復(fù)雜且不可逆的過程，由衰老導(dǎo)致的血管結(jié)構(gòu)和功能性改變是心血管疾病的主要危險因素。隨著人口老齡化的不斷加劇，研究對抗血管老化的干預(yù)措施不僅可以改善老年人的健康情況，而且可以通過延緩心血管疾病的相關(guān)死亡而延長老年人的壽命。

D-半乳糖是人體內(nèi)正常存在的還原糖，可被半乳糖氧化酶氧化形成H2O2，導(dǎo)致高水平的氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡。D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型是目前存在的多種衰老模型中最常見的，大量研究表明D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老嚙齒動物表現(xiàn)出的特征與自然衰老的嚙齒動物非常相似[14]。因此，長期注射D-半乳糖已被認為是研究衰老相關(guān)疾病（尤其是血管老化）機制的理想模型。在本實驗中，連續(xù)3個月的D-半乳糖誘導(dǎo)使衰老大鼠產(chǎn)生血管內(nèi)皮依賴性的舒張損傷，伴隨著血壓升高，這與之前關(guān)于血管老化的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明SO2處理使得衰老大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓都有了明顯降低、胸主動脈環(huán)最大舒張率也有了明顯提高，提示SO2可以減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老引起的血管內(nèi)皮功能障礙。

氧源性自由基增多引起的氧化應(yīng)激被廣泛認為是與衰老相關(guān)的重要因素，過量的超氧化物可以損害內(nèi)皮細胞功能并導(dǎo)致血管老化[15]。在此我們研究了SO2在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型中的抗氧化作用，結(jié)果表明，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型中脂質(zhì)氧化的兩種最終產(chǎn)物MDA和H2O2的水平均明顯增高，而SO2處理則可以降低MDA和H2O2的水平，減輕D-半乳糖引起的氧化應(yīng)激損傷。線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及NADPH氧化酶系統(tǒng)是細胞呼吸、代謝和吞噬作用產(chǎn)生ROS的主要部位，NADPH氧化酶生成的O2-可以經(jīng)SOD轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2再經(jīng)過過氧化氫酶轉(zhuǎn)化為H2O或在Fe2+存在的情況下轉(zhuǎn)化為羥基自由基[16]。此外，過氧化氫也可以被抗氧化劑如谷胱甘肽過氧化物酶降低。有報道，SO2預(yù)處理可以增加心肌缺血再灌注損傷大鼠血漿SOD水平和心肌SOD1蛋白表達[17]。在此，我們也檢測了衰老大鼠胸主動脈組織中SOD蛋白的活性及SOD1蛋白的表達情況，試圖驗證SO2是否是通過上調(diào)SOD1的表達或增加其活性來增加了衰老大鼠主動脈的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，SO2處理不影響SOD1的蛋白表達及其活性，這意味著SO2對活性氧的抑制可能是通過其他途徑進行的，有待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SO2可以減輕衰老大鼠的血管內(nèi)皮功能障礙，這可能與抑制氧化應(yīng)激、減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。這些結(jié)果為SO2可能成為一種潛在的治療老年患者血管內(nèi)皮功能紊亂的藥物提供了實驗依據(jù)，說明SO2具有潛在的臨床應(yīng)用價值。當(dāng)然，本實驗也存在著一些局限性，如SO2抑制活性氧的確切機制還未找到，還有待進一步的實驗驗證。此外，如果將SO2應(yīng)用于臨床，還要充分考慮其在超生理水平上的毒性作用。