半滑舌鰨性別決定和性別控制育種研究進(jìn)展與展望*

張全啟， 王旭波， 劉金相

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

性別是最普遍的生物學(xué)現(xiàn)象，許多生物的雌性和雄性在形態(tài)、生殖策略和行為上存在顯著差別。性別的形成受到性別決定的控制，又受到性腺分化的影響。性別決定與性腺分化相互聯(lián)系又有所區(qū)別；性別決定是確定性腺分化趨向，而性腺分化是具雙向潛力的未分化性腺經(jīng)過程序性發(fā)生的一系列事件，發(fā)育成精巢或卵巢，并出現(xiàn)第二性征的過程。

硬骨魚作為低等的脊椎動(dòng)物，是脊椎動(dòng)物中最大類群，其性別決定機(jī)制和性別分化呈現(xiàn)出多樣性，包括遺傳決定(GSD)、環(huán)境因素決定(ESD)和兩者共同決定(GSD + ESD)等模式[1-3]。此外，硬骨魚的性別表型不但有雌雄異體，還存在雌雄同體、性逆轉(zhuǎn)等特殊的生物學(xué)現(xiàn)象。

硬骨魚獨(dú)有的以上特點(diǎn)，為研究生物的性別決定和性腺分化等生物學(xué)過程提供了豐富的遺傳材料，可作為理想的模式生物來研究性別相關(guān)的生物學(xué)過程。闡明硬骨魚的性別決定方式，不僅有助于完善生物性別決定的基礎(chǔ)知識(shí)，對(duì)基礎(chǔ)研究貢獻(xiàn)巨大，在生產(chǎn)上通過性別控制育種也能達(dá)到增產(chǎn)效果，具有重要應(yīng)用價(jià)值。鑒于魚類性別決定研究在理論知識(shí)和生產(chǎn)實(shí)踐中均具有重要意義，國(guó)內(nèi)外科研人員在一系列硬骨魚中展開相關(guān)研究，從模式物種斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)，到大型經(jīng)濟(jì)物種尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、大西洋鮭(Salmosalar)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)和河鲀(Takifugurubripes)等均取得了突破性進(jìn)展[4-9]。

半滑舌鰨屬于鰈形目(Pleuronectiformes)舌鰨科(Cynoglossidae)舌鰨屬(Cynoglossus)是中國(guó)黃渤海地區(qū)近海底棲魚類，也是重要的經(jīng)濟(jì)物種。該物種雌雄個(gè)體差異巨大，雌性成體個(gè)體體長(zhǎng)是雄性個(gè)體的2～4倍，雌性成熟個(gè)體的體重可達(dá)雄性的8～10倍[10-11]。目前半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖在中國(guó)北方地區(qū)發(fā)展迅速，已成為規(guī)?；B(yǎng)殖的優(yōu)勢(shì)品種之一。然而，由于半滑舌鰨繁殖周期長(zhǎng)，且雌雄個(gè)體規(guī)格差異巨大，在同等條件下，如果養(yǎng)殖全雌魚或高雌性比例群體，可極大提高單位面積產(chǎn)量，進(jìn)而獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究半滑舌鰨性別決定的分子機(jī)制，為開展人工性別控制、單性品種或高雌性比例的養(yǎng)殖群體等提供理論基礎(chǔ)。

已有研究表明，半滑舌鰨有明顯的性染色體，屬于ZZ/ZW性染色體類型[12]，同時(shí)其性別決定不僅受遺傳因素決定，還受到環(huán)境因素的調(diào)控[8]。另外研究人員通過篩選半滑舌鰨雌性特異分子標(biāo)記，可以準(zhǔn)確的識(shí)別出其遺傳性別[13-14]。該物種獨(dú)特的生物學(xué)特征為研究硬骨魚的性別決定提供了理想的模型。本綜述就半滑舌鰨性別決定、環(huán)境因素誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象、性別控制育種等方面取得的重要進(jìn)展和研究成果分別進(jìn)行綜合介紹，并與其他魚類在相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行比較分析。

1 半滑舌鰨性別決定研究進(jìn)展

性別決定由性別決定基因啟動(dòng)，當(dāng)性別決定基因表達(dá)后，經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使生物體表現(xiàn)出雌雄性別表型。目前為止，僅在少量物種中鑒別出性別決定基因。在高等脊椎動(dòng)物的性別決定基因比較單一，但在硬骨魚中，性別決定系統(tǒng)異常復(fù)雜，其性別決定基因呈現(xiàn)出多樣性，到目前為止在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)的性別決定基因如表1所示。

表1 硬骨魚性別決定基因一覽表Table 1 Reported sex differentiation genes in teleost

對(duì)半滑舌鰨性別決定的研究起始于該物種存在性別二態(tài)性，雌性個(gè)體遠(yuǎn)大于雄性。周麗青等首先通過染色體觀察證明，半滑舌鰨有明顯的性染色體，其性別決定屬于ZZ/ZW類型，雌性個(gè)體擁有一個(gè)異形的W染色體[12]。在近二十年的研究中，通過差減文庫(kù)分析、基因克隆和性腺發(fā)育各時(shí)期表達(dá)量的變化等技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)和解析了一系列在雌雄性腺中表現(xiàn)出差異表達(dá)的基因，包括Amh、Amhr2、Wnt1a/b、Dmrt1、Gsdf、Sox9a、Dazl、Sf1、Figla、Sox10、Foxl2、Zp3a/b、cyp19a1a、GATA、Rspodin1等[8, 10, 20-27]。這些呈現(xiàn)出雌雄二態(tài)性表達(dá)的基因，部分偏向于雄性或雌性表達(dá)，部分表現(xiàn)為在整個(gè)生殖周期過程中動(dòng)態(tài)表達(dá)，其功能涉及類固醇激素的合成和調(diào)控、性腺發(fā)育、配子發(fā)生、成熟過程的調(diào)節(jié)等。

伴隨高通量測(cè)序技術(shù)的普及，半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組、基因組和甲基化組測(cè)序等技術(shù)平臺(tái)都相繼成熟，為后續(xù)性別決定基因的篩選提供了更為豐富的參考信息。通過對(duì)半滑舌鰨精巢和卵巢等轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析，篩選出大量雌雄表達(dá)差異的基因[28]。隨著半滑舌鰨基因組測(cè)序完成，結(jié)合雌魚、雄魚和偽雄魚轉(zhuǎn)錄組和甲基化組分析，半滑舌鰨的性別決定基因篩選范圍進(jìn)一步縮小，初步認(rèn)為Dmrt1基因是半滑舌鰨的性別決定基因[8, 28-29]。Cui等用基因編輯技術(shù)對(duì)半滑舌鰨Dmrt1基因進(jìn)行了基因編輯，發(fā)現(xiàn)ZZ型突變體的性腺發(fā)育成卵巢樣精巢，且精子發(fā)生過程被阻斷，該突變體比野生型ZZ個(gè)體表現(xiàn)出更快的生長(zhǎng)速度，其形體和大小與野生型ZW雌魚類似。在基因編輯的突變體中，研究人員還發(fā)現(xiàn)ZW型雌雄同體突變體，上下兩側(cè)性腺分別呈現(xiàn)出精巢和卵巢結(jié)構(gòu)。分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上側(cè)精巢中未發(fā)現(xiàn)Dmrt1突變，而下側(cè)卵巢的性腺中56%的Dmrt1基因發(fā)生了突變，推斷這是一個(gè)基因編輯的偽雄魚嵌合體。通過上述基因編輯結(jié)果，Cui等認(rèn)為Dmrt1基因是半滑舌鰨雄性決定基因，同時(shí)也是雄性精巢發(fā)育必不可少的[18]。

Dmrt1基因?qū)儆贒mrt基因家族，包含典型性的DM結(jié)構(gòu)域，一系列研究表明該基因在哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類中與性別決定與性腺分化、雄性性腺的發(fā)育和維持密切相關(guān)[30-35]。在許多物種中，Dmrt1基因已被廣泛研究，包括牙鲆(Paralichthysolivaceus)、尼羅羅非魚、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、青鳉、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、東方紅鰭鲀、革胡子鯰(Clariasgariepinus)、黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)、許氏平鮋(Sebastesschlegelii)和斑馬魚等，該基因在大部分硬骨魚中只在精巢和卵巢中表達(dá)，且在精巢中的表達(dá)量顯著高于精巢[31，34，36-45]。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，青鳉Dmrt1的同源基因DMY是雄性性別決定基因，該基因是Dmrt1基因發(fā)生復(fù)制后轉(zhuǎn)移Y染色體上產(chǎn)生的，當(dāng)DMY基因突變或過表達(dá)后，都會(huì)出現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[6-7]。與青鳉類似，Yoshimoto等在對(duì)兩棲動(dòng)物光滑爪蟾(Xenopusleavi)的研究中也發(fā)現(xiàn)，DMW基因是其性別決定基因，該基因是Dmrt1在W染色體上的一個(gè)特殊拷貝，當(dāng)DMW基因過表達(dá)或敲降后，會(huì)表現(xiàn)出性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[46-47]。

在半滑舌鰨中，Dmrt1基因已被克隆，該基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，Dmrt1基因是雄性精巢特異表達(dá)基因。在不同發(fā)育時(shí)期，Dmrt1基因在雌雄個(gè)體中呈現(xiàn)出顯著差別，在雌魚性腺中基因檢測(cè)不到Dmrt1基因的表達(dá)。在雄魚中，從發(fā)育到48天的仔魚中檢測(cè)到Dmrt1開始表達(dá)，70天表達(dá)開始升高，1年齡時(shí)，達(dá)到最高值[48-49]。染色體定位和基因組分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于Z染色體上，原位雜交結(jié)果顯示，Dmrt1主要在精巢的生殖細(xì)胞(Germ cell)和將來分化成支持細(xì)胞的體細(xì)胞(Presomatic cell)中表達(dá)[29]。這些結(jié)果都表明Dmrt1在半滑舌鰨性別決定或(和)性腺分化中發(fā)揮了重要作用。但是，單純根據(jù)少數(shù)基因編輯個(gè)體的表型就斷定Dmrt1是其性別決定基因這一結(jié)論有待進(jìn)一步確認(rèn)。首先，基因編輯的突變體都是原代個(gè)體，個(gè)體數(shù)量不明；再者，基因編輯發(fā)生在受精卵或胚胎發(fā)育的早期，而性腺分化是在變態(tài)后的幼魚時(shí)期，基因編輯如何能夠獲得上述一側(cè)性腺被編輯雌雄同體個(gè)體，或者說基因編輯的細(xì)胞為什么只在一側(cè)性腺中出現(xiàn)，尚無法解釋；此外，當(dāng)Dmrt1基因過表達(dá)后，會(huì)出現(xiàn)怎樣的性別表型變化，亦有待進(jìn)一步研究。

2 環(huán)境因素誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象

在高等脊椎動(dòng)物中，性別一旦形成，一般比較穩(wěn)定，不容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。在低等脊椎動(dòng)物中，其性別由遺傳物質(zhì)和環(huán)境因子共同決定，魚類作為低等的脊椎動(dòng)物，在發(fā)育過程中其性別的可塑性較大，除了遺傳因素的調(diào)控外，外界環(huán)境對(duì)其性別分化的影響也非常大。外界環(huán)境因子中的溫度對(duì)性別分化的影響尤其重要。在魚類中，性腺分化過程中由于環(huán)境因素影響而分化為假雄魚和假雌魚這一現(xiàn)象被稱為性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象(Sex reversal)，產(chǎn)生的假雄魚或者假雌魚被成為偽雄魚或者偽雌魚。大西洋銀漢魚(Menidiamenidia)是首先被發(fā)現(xiàn)溫度能改變性別比例的物種[50]，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)很多硬骨魚中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[1,3]。性別比例的偏離主要是性逆轉(zhuǎn)造成的，一般情況下是雌魚性逆轉(zhuǎn)成偽雄魚，導(dǎo)致雄性比例偏高。半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象產(chǎn)生的原因也多是環(huán)境溫度的變化過高或過低溫度能誘導(dǎo)雄魚的產(chǎn)生[1-2，51]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)來源的生理雄魚進(jìn)行了遺傳鑒定，并跟蹤調(diào)查了這些養(yǎng)殖群體苗種生產(chǎn)企業(yè)苗種培育水溫情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在保苗階段，或者說在苗種性別分化階段，不同的苗種培育溫度對(duì)后代的生理性別產(chǎn)生較大影響(見表2)。溫度越高，偽雄魚的比例也越高，育苗水溫達(dá)到24 ℃時(shí)，生理雄魚中偽雄魚的比例可達(dá)37%。保苗溫度與偽雄魚比例間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P=0.986)。

表2 半滑舌鰨不同人工養(yǎng)殖群體的生理雄魚中偽雄魚的比例Table 2 Detection of pseudomales in different cultured stocks of Chinese tongue sole

①M(fèi)ale stocks(Batch);②Source of fingerling(Batch);③Time of fingerling production;④Temperature;⑤Number of individuals;⑥Average body weight;Number of pseudomalse;⑧/Percentage of pseudomales

一系列研究發(fā)現(xiàn)，高溫或雄性激素誘導(dǎo)以及養(yǎng)殖群體中自然性逆轉(zhuǎn)的偽雄魚，其表現(xiàn)出的精巢性狀跟雄魚類似[8,48,52-53]，在進(jìn)行相關(guān)遺傳學(xué)研究時(shí)必須對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。由于半滑舌鰨存在明顯的W性染色體，且其較大易于區(qū)分，Wang等通過染色體切割技術(shù)對(duì)W染色體進(jìn)行了切割，建立了W染色體特異的基因組文庫(kù)，從而開發(fā)了雌性特異的分子標(biāo)記[54]；另有研究分別開發(fā)了性別特異的AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記[55-56]。這些性別特異分子標(biāo)記的開發(fā)為鑒別半滑舌鰨的遺傳性別提供了有利工具，結(jié)合表型性別的觀察，可以準(zhǔn)確的鑒定雌魚、雄魚和偽雄魚(見圖1)。

(A.遺傳雌雄的PCR擴(kuò)增結(jié)果，雌性有特異的條帶；B.養(yǎng)殖群體的生理雄魚中偽雄魚的識(shí)別，箭頭所指為偽雄魚。A.PCR amplification results in genetic males and females, females with a specific band. B.Identification of pseudomales from physiological males. Arrows show the pseudomales with a female specific band.)

圖1 半滑舌鰨遺傳性別的分子鑒定
Fig. 1 Genetic sexing of Chinese tongue sole

性逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的偽雄魚在遺傳性別上和雌魚相同，都是ZW型個(gè)體，但表型和ZZ型雄性個(gè)體相似。深入的分析發(fā)現(xiàn)，性逆轉(zhuǎn)個(gè)體的表觀遺傳特性發(fā)生了巨大的變化。全基因組甲基化測(cè)序發(fā)現(xiàn)偽雄魚和雄魚基因組甲基化水平整體比較相似，都表現(xiàn)出較高的甲基化水平，與正常雌魚相比甲基化水平差異顯著[8]。半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)個(gè)體不僅在基因組整體上甲基化水平具有顯著差異，對(duì)性別相關(guān)基因包括piwi、GATA4、GATA6、cyp19a1a等的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在不同性別的個(gè)體中這些基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平不同，其甲基化模式也存在顯著差別，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)量的變化和甲基化水平呈現(xiàn)出相關(guān)性[23-24,52，57]。Liu等最近的研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨偽雄魚cyp19a1a啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平是雌魚中的兩倍，而且和雄魚的甲基化模式類似。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cyp19a1a啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平可影響轉(zhuǎn)錄因子CREB的結(jié)合并調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步影響雌雄類固醇激素的比例，從而引起下游一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響性別表型[52]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，偽雄魚能夠產(chǎn)生有功能的配子，但受精率和孵化率顯著低于正常雄魚來源的精子，其后代的生長(zhǎng)性狀與正常雄魚后代存在顯著差異[58]。Shao等研究發(fā)現(xiàn)偽雄魚產(chǎn)生的后代生長(zhǎng)速率緩慢，同時(shí)證明了偽雄魚的表觀遺傳改變可通過遺傳物質(zhì)傳遞給子代個(gè)體[8]。在正常的養(yǎng)殖群體中，半滑舌鰨只有部分雌魚會(huì)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)發(fā)育偽雄魚， Jiang和Li 通過GWAS分析發(fā)現(xiàn)，位于Z染色體上的FBXL17基因的SNP位點(diǎn)(A/T)與該現(xiàn)象相關(guān)，ZAW型雌魚不會(huì)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，但ZTW型雌魚較為敏感，在外界環(huán)境的影響下容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)[59]。在半滑舌鰨Dmrt1基因第三內(nèi)含子的SNP(A/G)也有類似現(xiàn)象，當(dāng)該SNP的基因型為T時(shí)，雌性個(gè)體易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)[60]。綜合上述研究結(jié)果，可以推測(cè)偽雄魚的產(chǎn)生受到表觀遺傳修飾的調(diào)控，某些基因的SNP突變，會(huì)引起對(duì)環(huán)境敏感程度的差別，帶有敏感突變的個(gè)體更容易受到環(huán)境因子的影響而發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。環(huán)境因素誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)，尤其是溫度對(duì)性別的影響，在兩棲類和爬蟲動(dòng)物中也有發(fā)現(xiàn)[61-62]。關(guān)于性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象產(chǎn)生的分子機(jī)制被廣泛研究，不同學(xué)者從不同的角度對(duì)該問題進(jìn)行了深入探討，發(fā)現(xiàn)類固醇激素、糖皮質(zhì)激素和表觀遺傳修飾等因素在性逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[63-71]。在爬行類中，Deveson等發(fā)現(xiàn)在JARID2和JMJD3剪切過程中內(nèi)含子保留(Intron retention，IR)可介導(dǎo)澳大利亞蜥蜴(Pogonavitticeps)的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[72]。在溫度敏感型巴西紅耳龜(Trachemysscripta)和美洲鱷(Alligatormississippiensis)中，cyp19a1a能調(diào)控類固醇激素的比例，從而改變表型性別[73-74]。在硬骨魚中，關(guān)于高溫誘導(dǎo)后趨向雄性化這一現(xiàn)象和表觀遺傳修飾之間的關(guān)系在歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)、尼羅羅非魚、虹鱒和半滑舌鰨中已陸續(xù)展開，研究發(fā)現(xiàn)cyp19a1a基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與性別密切聯(lián)系[52, 69, 75-76]。在牙鲆中發(fā)現(xiàn)FOXL2和SOX9甲基化也呈現(xiàn)出性別二態(tài)性[77]。另外，HSPs、TRPs、CIRBPs和microRNA在環(huán)境因子對(duì)性別的影響過程中發(fā)揮重要作用[78-82]。在雌雄同體的尖吻鱸(Latescalcarifer)中dmrt1和cyp19a1不僅存在性別特異的甲基化水平，還存性別特異的剪切[83]。

上述的研究表明，環(huán)境因子與遺傳信息互作對(duì)半滑舌鰨等許多硬骨魚性別分化的影響體現(xiàn)在表觀遺傳修飾上，通過表觀遺傳修飾，可調(diào)控性別決定或性腺分化相關(guān)基因及信號(hào)通路的表達(dá)，從而影響性腺分化和配子發(fā)生。然而，在環(huán)境影響基因表達(dá)調(diào)控方面，非編碼RNA的功能卻少有涉及。已有的研究表明，在斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)miR-27b-3p直接靶向piwi2和mov10l1的3’UTR并下調(diào)其表達(dá)[84]；miR-141 和miR-429在黃顙魚精巢發(fā)育和精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用[85]；在黃鱔(Monopterusalbus)中，miR-19a/b能夠直接抑制性逆轉(zhuǎn)期dmrt1的表達(dá)[86]；牙鲆piRNA信號(hào)通路基因經(jīng)歷了快速的進(jìn)化，它們?cè)谛坌跃仓懈弑磉_(dá)，與雄性偏向的piwi基因的高表達(dá)相協(xié)調(diào)，可能在精巢發(fā)育和精子發(fā)生中發(fā)揮重要功能[87]。這些非編碼RNA是否直接受到環(huán)境因子變化的影響，以及相關(guān)變化怎樣通過影響相關(guān)靶基因的表達(dá)調(diào)控性腺分化等，均未見報(bào)道。因此，在以后的研究中轉(zhuǎn)錄水平上非編碼RNA對(duì)性別分化的調(diào)控是值得探討的內(nèi)容。此外，性別分化相關(guān)基因在蛋白水平上磷酸化、乙?；揎椀葘?duì)性別分化的影響也有待探討。

3 半滑舌鰨性別控制育種

半滑舌鰨雌性個(gè)體遠(yuǎn)大于雄性個(gè)體，在養(yǎng)殖過程具較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提高養(yǎng)殖群體的雌性比例或培育全雌苗種對(duì)半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)意義巨大。對(duì)于ZZ/ZW性別決定型的半滑舌鰨來說，培育全雌苗種的理想方法是，首先獲得WW染色體組成的超雌魚，然后通過WW超雌魚與普通ZZ雄魚交配，獲得ZW全雌后代。獲得WW超雌魚的有效途徑有兩個(gè)，一是開展雌核發(fā)育，能夠獲得ZZ和WW兩種雌核發(fā)育個(gè)體；另一個(gè)是培育或篩選ZW偽雄魚，通過偽雄魚與正常ZW雌魚交配，理論上可以獲得的后代中有四分之一為WW超雌魚。

3.1 半滑舌鰨雌核發(fā)育研究

本實(shí)驗(yàn)室通過采集ZZ型雄魚的精子，并參考戈文龍等的方法用紫外線進(jìn)行失活處理，利用靜水壓力方法誘導(dǎo)雌核發(fā)育[88]，成功獲得了多批次雌核發(fā)育個(gè)體。待雌核發(fā)育個(gè)體生長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)，隨機(jī)選取94尾，提取DNA樣本，與雌性親本及提供精子的雄性親本一起進(jìn)行PCR分子遺傳性別鑒定。結(jié)果表明，所有雌核發(fā)育后代的遺傳性別均與雄性親本一致，而與雌性親本不同，缺少W特異的分子標(biāo)記(見圖2 A)，隨機(jī)選取10尾進(jìn)行染色體觀察顯示，所有個(gè)體的染色體組成均為ZZ型(見圖2 C)，沒有觀察到雌雄個(gè)體應(yīng)有的W染色體(見圖2 B)。這一結(jié)果表明，雌核發(fā)育后代全部為ZZ型遺傳雄性，WW型雌性個(gè)體不能存活。Chen等報(bào)道在其雌核發(fā)育研究時(shí)，孵化2天的仔魚中發(fā)現(xiàn)有WW超雌魚苗[55]，但未對(duì)較大的幼魚進(jìn)行檢測(cè)。顯然，WW超雌魚未能成活到5 cm左右的稚魚，那么，WW雌魚到底什么時(shí)候死亡的，有待進(jìn)一步探討。

(A：雌核發(fā)育用雌性親本、雄性親本及獲得后代的分子標(biāo)記檢測(cè)，所有后代全部為雄性；B：一般雌雄個(gè)體的染色體，箭頭示W(wǎng)染色體；C：雌核發(fā)育后代的染色體，全部為ZZ型。A: PCR amplification of female and male parents and the gynogens, all gynogens do not have the female specific marker. B: Chromosomes of normal female individual with arrow indicating the W chromosome. C: Chromosomes of diploid gynogen, with all individuals show ZZ chromosomes.)

圖2 半滑舌鰨雌核發(fā)育后代的性別特異分子標(biāo)記檢測(cè)及染色體觀察
Fig. 2 Identification of gynogens with female specific marker and chromosome observation

3.2 利用偽雄魚培育WW超雌個(gè)體

利用雌性特異標(biāo)記篩選方法[14, 54]，于2006—2007年分別從2005和2006年培育的苗種中篩選獲得偽雄魚817尾(見表2)，分別于2007和2008年進(jìn)行了偽雄魚后代的培育，共培育苗種5萬余尾。至苗種一月齡時(shí)，分別從2007和2008年度的苗種中各取400尾，用雌雄特異分子標(biāo)記后代進(jìn)行了遺傳性別鑒定，結(jié)果顯示，2007年度偽雄魚的后代中，遺傳雌性的比例為53.6%，同期普通對(duì)照組雌性比例為47%，兩者沒有顯著差異；2008年度偽雄魚的后代中，遺傳雌性的比例為48.5%，同期普通對(duì)照組雌性比例為48.3%，兩者也沒有顯著差異[58]。

從分子標(biāo)記確認(rèn)的一月齡遺傳雌性仔魚中，隨機(jī)挑取200尾進(jìn)行了染色體觀察，結(jié)果有167尾成功地觀察點(diǎn)清晰可辨核型的染色體，這些個(gè)體全部為ZW型遺傳雌性，未觀察到WW個(gè)體的存在。在前期利用FISH雜交研究rDNA分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，在半滑舌鰨雄性染色體組中有3對(duì)雜交信號(hào)，而在雌雄染色體組中，有7個(gè)明顯的雜交信號(hào)，除與雄性相同的3對(duì)信號(hào)外，在W上有一個(gè)較大區(qū)段的rDNA分布(見圖3)。為了驗(yàn)證對(duì)偽雄魚后代分子鑒定及染色體觀察的結(jié)果，以18S rDNA為探針，對(duì)觀察到的染色體進(jìn)行原位雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有觀察到的遺傳雌性個(gè)體的染色體組中，都有且只有7個(gè)雜交信號(hào)，包括3對(duì)成對(duì)的信號(hào)和一個(gè)W染色體特異信號(hào)(見圖3)。充分證明，在偽雄魚的后代中，不存在WW超雌魚。

(A：在雄性染色體組中有3對(duì)雜交信號(hào)，分別為箭頭、#箭頭和空箭頭；B：雌性染色體組中有7個(gè)雜交信號(hào)，小箭頭示W(wǎng)染色體特異rDNA信號(hào)。偽雄魚的所有雌性后代染色體組都與B相同。A: Male karyotype shows 3 pairs of rDNA bearing chromosomes, arrows, # arrows and hollow arrows; B: Female karyotype shows 3 pairs of rDNA bearing chromosomes and an additional big W chromosome signal.)

圖3 18S rDNA在半滑舌鰨染色體組中的分布
Fig.3 Distribution of 18S rDNA in the chromosomes of Chinese tongue sole

對(duì)2007年度培育的苗種進(jìn)行了養(yǎng)殖測(cè)試，2008年度培育的苗種，因與2007年度組一樣，經(jīng)過遺傳鑒定也沒有發(fā)現(xiàn)WW超雌魚，所以，直接放棄養(yǎng)殖測(cè)試。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，偽雄魚后代生長(zhǎng)速度顯著低于普通組，至7月齡時(shí)，偽雄魚后代中遺傳雌性個(gè)體的平均體長(zhǎng)為18.3 cm，對(duì)照組為22.2 cm，對(duì)照組比偽雄組大21.3%，偽雄組和對(duì)照組遺傳雄性個(gè)體的平均體長(zhǎng)分別為16.7和17.6 cm，兩者沒有明顯差異(見表3)，因此，偽雄魚后代在整體是生長(zhǎng)較慢是由于其中遺傳雌雄個(gè)體生長(zhǎng)速度較慢造成的。

首先，關(guān)于偽雄魚后代的雌雄比例，本研究發(fā)現(xiàn)其雌雄比為1∶1，與普通雄魚后代比例一致。理論上說，ZW×ZW雜交后代的比例為ZZ∶ZW∶WW=1∶2∶1，由于后代中不存在WW個(gè)體，且ZW個(gè)體與ZZ個(gè)數(shù)相等，因此，很容易想到雜交親本中一方來源的W配子不存在或不能正常受精發(fā)育。事實(shí)上，Cui等后來的研究證實(shí)，偽雄魚不能產(chǎn)生W型精子[60]，這證實(shí)了本研究的觀察結(jié)果，即：WW超雌個(gè)體是不存在的，通過偽雄魚培育WW超雌魚進(jìn)而培育全雌品種的途徑是行不通的。

關(guān)于偽雄魚后代的的生長(zhǎng)速度，發(fā)現(xiàn)偽雄魚后代生長(zhǎng)速度明顯較對(duì)照組慢，且這些差異主要是由于偽雄魚后代中遺傳雌性的生長(zhǎng)速度慢造成的。Shao等研究也發(fā)現(xiàn)偽雄魚的后代生長(zhǎng)緩慢，且其中生理雄性比例極高[8]，后來，Jiang和Li證實(shí)，在半滑舌鰨Z染色體上的FBXL17基因存在一個(gè)SNP位點(diǎn)(A/T)，ZTW型個(gè)體對(duì)外界溫度變化較為敏感，更容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)[59]，Dmrt1基因第三內(nèi)含子的SNP(A/G)也與雌性個(gè)體溫度易感性相關(guān)[60]。因此，偽雄魚這一性狀是遺傳的，容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)變成偽雄魚的個(gè)體，多數(shù)攜有溫度敏感型SNP位點(diǎn)，其后代也繼承了相應(yīng)SNP位點(diǎn)，也容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)成為偽雄魚。

表3 半滑舌鰨偽雄魚后代中遺傳雌雄個(gè)體的比例及其生長(zhǎng)狀況比較Table 3 The percentage and the growth rate of male and female offspring of pseudomales

3.3 半滑舌鰨三倍體的培育與養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

由于半滑舌鰨性染色體結(jié)構(gòu)的特殊性，使得全雌苗種的諸多嘗試均未獲得理論上預(yù)料的成果，因?yàn)樵S多動(dòng)物中都已證實(shí)三倍體比二倍體有一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[89-91]， 國(guó)內(nèi)不少學(xué)嘗試了半滑舌鰨多倍體育種。劉志鵬等通過冷休克誘導(dǎo)方法成功誘導(dǎo)出半滑舌鰨三倍體，發(fā)現(xiàn)雌雄ZWW/ZZZ核型出現(xiàn)的頻率為1∶1，雌性性別比例并沒有顯著提高，同時(shí)在誘導(dǎo)的三倍體中沒有發(fā)現(xiàn)ZZW型雌魚[92-93]。李文龍用靜水壓力誘導(dǎo)了半滑舌鰨三倍體和四倍體，，研究發(fā)現(xiàn)三倍體同二倍體相比，性腺發(fā)育會(huì)出現(xiàn)明顯的受阻現(xiàn)象，性別鑒定發(fā)現(xiàn)，三倍體中雌魚的比例僅為11%，雌性率顯著低于正常二倍體群體，三倍體生長(zhǎng)速度和二倍體沒有顯著差異[94]。為何不同處理組的三倍體在雌雄比例上存在較大差異，有待進(jìn)一步探討，但已有的研究成果表明，通過誘導(dǎo)多倍體提高半滑舌鰨的雌性率或者實(shí)現(xiàn)性別控制育種的方法也是不可行的。

4 總結(jié)與展望

半滑舌鰨的雌雄差異及其性染色體的存在，使其成為性別決定、性腺分化和性別控制育種的優(yōu)選研究對(duì)象。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中雌性個(gè)體生長(zhǎng)快、個(gè)體大，養(yǎng)殖效益高，有效提高雌性比例是水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)所祈求的。然而，在苗種生產(chǎn)過程中，為了保證苗種成活率和生長(zhǎng)速度，生產(chǎn)企業(yè)往往采用較高的水溫，這就造成了苗種中高比例的雌魚發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，成為生理雄魚。為了解決雌性苗種偏少，培育全雌苗種問題，國(guó)內(nèi)多個(gè)團(tuán)隊(duì)開展了多年的努力，包括傳統(tǒng)的細(xì)胞工程育種如雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)，通過篩選偽雄魚進(jìn)行雜交育種，通過基因編輯等手段，根據(jù)已有的研究成果發(fā)現(xiàn)，相比XY型性染色的物種，傳統(tǒng)的育種方法尤其是細(xì)胞工程育種，對(duì)半滑舌鰨的性別控制育種并不適用，通過偽雄魚進(jìn)行雜交的方法也無法達(dá)到理想的目的，原因是半滑舌鰨性染色體分化較大，ZW偽雄魚無法生產(chǎn)W型精子，雌核發(fā)育和偽雄魚雜交均無法獲得理想中的WW超雌魚，因此，要通過超雌魚培育全雌品種的路徑是不可行的。

近年來伴隨新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，尤其是基因編輯技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)在模式動(dòng)植物中展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，在作物性狀改良方面效果顯著，在水生動(dòng)物中也得到應(yīng)用，尤其是在淡水生物中，相關(guān)研究工作也廣泛展開。受制于海水物種的特殊性，基因編輯技術(shù)在海洋動(dòng)物中的應(yīng)用相對(duì)滯后。在最近的研究中，Cui等通過TALEN技術(shù)對(duì)半滑舌鰨進(jìn)行了基因編輯，運(yùn)用該技術(shù)成功敲除Dmrt1基因，敲除Dmrt1基因的遺傳雄性個(gè)體表現(xiàn)出和雌性個(gè)體相似的表型[18]。但怎樣利用基因編輯技術(shù)在半滑舌鰨上實(shí)現(xiàn)性別控制育種，提高雌性比例，還有待大量的研究。

已有全基因組關(guān)聯(lián)分析研究證實(shí)，半滑舌鰨中存在對(duì)環(huán)境敏感的SNP位點(diǎn)[59-60]，攜有敏感位點(diǎn)的雌雄個(gè)體容易受到高溫等環(huán)境因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的性逆轉(zhuǎn)，從而減少養(yǎng)殖群體中生理雌性個(gè)體的比例，降低養(yǎng)殖效益。因此可以預(yù)期，利用分子篩選技術(shù)，在養(yǎng)殖苗種培育前剔除帶有敏感SNP位點(diǎn)的親本，保留對(duì)溫度不敏感的親本，雖然該方法無法獲得全雌群體，但理論上可以有效地減少人工苗種中偽雄魚的出現(xiàn)比例，提高養(yǎng)殖群體中生理雌魚的比例，提高養(yǎng)殖效益，因此，這可能成為半滑舌鰨性別控制育種的有效手段和新途徑。