原始森林高產(chǎn)纖維素酶刺器腐霉的篩選鑒定

何海燕，付躍，秦文芳，張玉蘭，甘小富，覃擁靈，*

（1.河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室，廣西宜州546300）

纖維素是植物纖維的主要成分，約占植物總干重的30%～50%[1]，是分布最廣的天然碳水化合物，也是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。Z˙ywicka 等估計全世界每年通過光合作用產(chǎn)生的纖維素高達1.55×109噸，其中89%尚未被人類利用[2]。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為人類急需的能源食物和化工原料，對人類社會的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義。纖維素酶在食品、飼料、紡織和洗滌等行業(yè)具有較大的應用潛力。Stevenson 研究認為篩選出產(chǎn)高活性纖維素酶的菌株是開發(fā)利用纖維素資源的前提和關鍵[3]。

本課題以原始森林腐爛木材下的土壤為原料，以羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）為唯一碳源進行篩選，純化并經(jīng)過剛果紅染色鑒定后，得到4 株產(chǎn)透明圈的菌株。對該菌株進行葡聚糖內(nèi)切酶（endo-glucanase，CMCase）活性鑒定，完成高產(chǎn)纖維素酶菌種篩選鑒定研究，為纖維素酶進一步的研究工作奠定了基礎。

1 材料與儀器

1.1 試劑

參照張煒煒方法配置pH 4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液[4]；3，5-二硝基水酸溶液：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；0.9%生理鹽水：微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室配置；參照杜健配置3，5-二硝基水楊酸溶液（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）[5]；參照陳玉方法配置1%CMC-Na[6]，溶液稱取0.625 g 羧甲基纖維素鈉，加熱溶解于pH4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液并定容至100 mL。

樣品：采自廣西羅城小長安水上相思林原始森林腐木下，取腐爛木材地表下5 cm～15 cm，100 g，保鮮膜密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設備

BX51 顯微鏡：奧林巴斯（OLYMPUS）專業(yè)公司；GZX-GF101-2S 電熱恒溫鼓風干燥箱、SPX-150 生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；UV-2802 紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LDZX-5OFAS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；xMark 酶標儀：BIO-RAD 公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；YHG-型搖床：上海欣蕊自動設備有限公司。

2 試驗方法

2.1 培養(yǎng)基配置

參照Saritha 等的方法配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板和斜面培養(yǎng)基[7]：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7。

參照張靜靜方法配置CMC-Na 篩選培養(yǎng)基[8]：CMC-Na 5 g，牛肉浸膏1 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO31 g，K2HPO31 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH7，121 ℃滅菌 20 min。

應用 Biochof 等的產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]：CMC-Na 5 g，酵母膏 2g，MgSO45g，水 1000mL，pH7。每個培養(yǎng)瓶 250mL。

2.2 樣品處理

將原始森林腐爛木材下的土壤樣品梯度稀釋，各取10-4～10-63 個稀釋度0.1 mL 涂布以CMC-Na 為唯一碳源的篩選平板，37 ℃倒置培養(yǎng)72 h，分離旺盛生長的菌株。

2.3 剛果紅染色鑒定法

采用張煒煒剛果紅染色鑒定法[10]，將所分離的菌株活化后，點樣接種于篩選培養(yǎng)基CMC-Na 平板并做好標記，倒置培養(yǎng)72 h，加入適量1 mg/mL 剛果紅溶液，染色3 h 后棄去染液，加入適量1 mol/L NaCl 溶液脫色1 h。根據(jù)透明圈大小及透明圈菌落直徑比選擇產(chǎn)酶菌株。

2.4 接種和產(chǎn)酶培養(yǎng)

將平板上的單菌落挑起，在斜面培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)。每天觀察，待菌種長后，用10 mL 生理鹽水洗下制成孢子液或單細胞菌懸液（部分留作甘油種），取1 mL轉(zhuǎn)入產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，100 r/min，培養(yǎng)3 d。

2.5 粗酶液的制備

應用何海燕等的粗酶液的制備方法[11]，取1 mL 孢子懸液或單細胞菌懸液轉(zhuǎn)入產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，100 r/min，培養(yǎng)3 d，將纖維素酶發(fā)酵液用6 層紗布過濾，4 000 r/min，離心10 min，上清液即為粗酶液。

2.6 纖維素酶酶活性檢測

參照盧憲芹配制葡萄糖標準液[12]：將葡萄糖放在110 ℃烘箱中烘2 h 至恒重，稱取0.108 g 葡萄糖，用蒸餾水溶解定容至100 mL 制成6 μmol/mL 的葡萄糖標準液。

取6 支洗凈烘干的20 mL 具塞刻度試管，編號后分別加入 1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補加蒸餾水至總體積為2 mL，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入2 mL DNS 溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷至25 ℃后，用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。在540 nm波長下，以1 號試管溶液作為空白對照，調(diào)零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結(jié)果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制標準曲線。計測出其在540 nm 處的吸光度，得出還原糖的量。

參照宋嶸錫的羧甲基纖維素酶活力（CMCase）的測定方法[13]：取4 支洗干凈烘干的試管，編號后，取1%的 CMC-Na 溶液 3.8 mL（CMC-Na 溶于 pH 值為 4.8 的醋酸緩沖液）作為底物，同時一號試管加入3.8 mL 蒸餾水作為空白對照組，50 ℃保溫酶解反應30 min，加入經(jīng)稀釋10 倍的粗酶液0.2 mL，于50 ℃反應30 min，加入1 mL DNS，1 mL 2 mol/L NaOH，沸水浴10 min，冷卻后加水稀釋到25 mL，于540 nm 測定還原糖量。以1 號試管溶液為空白對照調(diào)零點，在540 nm 波長下測定2、3、4 號試管液的吸光度值并記錄結(jié)果。根據(jù)3 個重復光密度的平均值，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，計算出CMC 酶活力。

2.7 菌落形態(tài)觀察

通過對平板生長菌落的形態(tài)、大小、顏色、菌絲及孢子的觀察對菌落進行初步鑒定。

2.8 顯微觀察

參照高鴻健插片法[14]：用鑷子把滅過菌的蓋玻片斜插入涂布接種的PDA 平板培養(yǎng)基上，每塊板插3片～5 片，培養(yǎng)3 d～5 d，可以在不同生長期小心取出蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、孢子的形態(tài)。

2.9 分子鑒定

菌體總DNA 的提取：新鮮培養(yǎng)的菌絲加入液氮，在研缽中充分研磨變成粉末，總DNA 的提取參照Michaelson 等方法進行[15]。總 DNA 純化晾干后加 100 μL TE 緩沖液（pH7.4）充分溶解后在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴展5.8S 核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)域DNA 序列（internally transcribed spacer regions and the ribosomal，ITS） 鑒定菌種：PCR 引物按 White 等報道設計[16]，引物 ITS1 的序列：5`TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3`，引物 ITS4 的序列：5`TCCTCCGCTTATTGATATGC3`。PCR 擴增體系為：10×Ex Taq 緩沖液 5 μL，菌體總 DNA 2 ng，10 mmol/L dNTP 1 μL，20μmol/L ITS1 引物 0.5 μL，20μmol/L ITS4引物0.5μL，TaqTM聚合酶2U，加去離子水補足至50μL。

PCR 反應條件為：95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 50 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR 純化試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，對ITS 基因片段測序，利用BLAST 軟件在NCBI 進行同源性比較。檢索得到的同源性較高的序列用Vector NTI 軟件整理排列，用分子進化遺傳分析軟件MEGA7，neighbor joining method 構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)纖維素酶細菌的篩選

樣品經(jīng)富集之后，在篩選培養(yǎng)基上共篩選出12 株長勢良好的菌株，經(jīng)篩選培養(yǎng)基原位多次點種剛果紅染色鑒定，有4 個菌落周圍均有透明圈，2 號菌株產(chǎn)生的透明圈大而清晰，直徑可達21 mm，將此菌株命名為H-2。

3.2 菌株的酶活測定結(jié)果

根據(jù)葡萄糖標準溶液光密度測定結(jié)果，繪制葡萄糖標準曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose concentration

H-2 液體培養(yǎng)3 d，測定粗酶活性，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，計算出CMC 酶活為130 U/mL。試驗結(jié)果表明，H-2 菌株分泌CMC 酶的能力較強，有進一步研究開發(fā)的價值。

3.3 菌株的形態(tài)和顯微鑒定

H-2 菌株在PDA 平板上培養(yǎng)4 d 后的生長情況見圖2。

圖2 H-2 菌株在PDA 平板上培養(yǎng)4 d 后的生長情況Fig.2 Growth of H-2 strain cultured on PDA plate for 4 days

H-2 菌落在PDA 平板上形成由中心向外3 層的菌圈，菌落中心為黃白色油狀滴，往外為藍紫色圈，菌落為絲狀菌絲，最外層為較大的白色絨狀圈，在PDA培養(yǎng)基生長3 d 直徑可達3 cm。

H-2 菌株剛果紅染色產(chǎn)生的透明圈見圖3。

圖3 H-2 菌株剛果紅染色產(chǎn)生的透明圈Fig.3 H-2 produced clear hydrolytic zone around its colony on a Congo red dyeing agar plate

H-2 菌在CMC-Na 上培養(yǎng)3 d，經(jīng)剛果紅染色出現(xiàn)較大透明圈，直徑達2 cm～3 cm。

H-2 菌株的光學顯微鏡圖見圖4。

圖4 光學顯微鏡圖Fig.4 Optical microscope

利用插片法在光學顯微鏡下觀察，H-2 菌絲有分枝，且有橫隔，分生孢子梗聚集，呈條狀，表面光滑，顯綠色。

H-2 掃描電子顯微鏡相片見圖5。近端處分枝，孢子絲發(fā)育到一定階段便分化為分生孢子，孢子橢圓形，孢子囊絲狀有隔膜，孢子橢圓形。孢子囊相互連接。H-2 菌株菌落形態(tài)特征、顯微特征都和霉菌屬菌株一致，依據(jù)魏景超方法初步推斷為霉菌屬菌株[17]。

圖5 H-2 掃描電子顯微鏡相片F(xiàn)ig.5 The scanning electron micrograph of H-2

3.4 菌種分子鑒定

H-2 系統(tǒng)進化樹見圖6。

圖6 H-2 系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of H-2

依據(jù)Bruns 等和Gardes 等方法，ITS 序列在相同物種之間高度同源，是物種鑒定的可信的基因標記[18-19]。PCR 成功擴增得到 02 菌株 ITS 序列 752bp，BLAST 比對，以比對得到的相近ITS 序列建立進化樹。02 系統(tǒng)進化樹顯示，02 菌株和刺器腐霉 （Pythium acanthophoron）處于進化樹同一分支上，兩者ITS 位點序列有100%的相似性，表明該菌株和刺器腐霉（P.acanthophoron）分類地位很接近，有很近的親緣關系。

4 結(jié)論

原始森林土壤中蘊含豐富微生物菌種資源，從原始森林取樣可以篩選得到酶學性質(zhì)優(yōu)良的菌種。從廣西羅城原始森林取樣篩選到4 株產(chǎn)纖維素酶菌株，其中經(jīng)剛果紅染色法證明H-2 在CMC-Na 篩選平板上形成的透明圈和菌落直徑最大，產(chǎn)羧甲基纖維素酶的能力強，液體發(fā)酵粗酶活測定發(fā)現(xiàn)，H-2 菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)3 d，羧甲基纖維素酶活力達130 U/mL。H-2 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征鑒定為細菌桿菌屬菌株，羧甲基纖維素酶活較高，具有良好的應用前景。

研究表明，腐霉屬（Pythium Pringsheim）可以產(chǎn)纖維素酶[20-22]，但未見刺器腐霉（P.acanthophoron）產(chǎn)纖維素酶報道。課題計劃繼續(xù)開展刺器腐霉發(fā)酵條件優(yōu)化、纖維素酶純化及酶學特性研究，為該菌進一步運用打下試驗基礎。