親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物源食品中10種氨基糖苷類藥物的殘留量

宓捷波，張敏，柴銘駿，劉旸，常春艷

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心，天津300461）

氨基糖苷類藥物是由鏈霉菌或小單胞菌培養(yǎng)液中提取，或合成的一類水溶性堿性抗生素，可作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，并破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，對(duì)需氧革蘭氏陰性菌、單胞菌屬、葡萄球菌屬及結(jié)核桿菌均有抗菌活性[1-3]。氨基糖苷類藥物核心的分子結(jié)構(gòu)為一個(gè)氨基環(huán)醇環(huán)和一個(gè)或多個(gè)氨基糖分子通過配糖鍵相連接，典型的代表藥物有鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素等。在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中，氨基糖苷類藥物可以有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖，因此常被作為獸藥治療家畜腸炎、赤皮病、白頭白嘴病等。由于對(duì)藥物的不合理使用及違法使用等情況，導(dǎo)致的氨基糖苷類抗生素在食品中殘留問題，已經(jīng)引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注。如美國、加拿大等國相關(guān)機(jī)構(gòu)調(diào)查發(fā)現(xiàn)鏈霉素是僅次于青霉素的最常在動(dòng)物中殘留超標(biāo)的藥物；國內(nèi)也曾在豬腎豬肝中檢出嚴(yán)重超標(biāo)的鏈霉素。醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類藥物雖然具有強(qiáng)大的殺菌作用，但會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成異常，從而引發(fā)口周和手足麻木、神經(jīng)性的肌肉阻滯，蛋白尿、腎小球?yàn)V過減少、氮質(zhì)血癥等腎臟疾病。因此，有必要對(duì)動(dòng)物源食品中的氨基糖苷類藥物殘留進(jìn)行檢測。

氨基糖苷類藥物的檢測本身并不困難，如微生物法[4]、酶聯(lián)免疫法[5-8]、液相色譜法[9-12]、氣相色譜法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-19]等都曾用于食品、生物體液及環(huán)境中氨基糖苷類藥物的檢測。對(duì)于食品中氨基糖苷類藥物的殘留分析而言，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其特有的定性定量準(zhǔn)確的特征成為近年來食品行業(yè)中的重要方法。由于氨基糖苷類藥物極性大，在常規(guī)反相色譜柱上保留性能不佳，往往采用在流動(dòng)相中加入烷基磺酸鈉或七氟丁酸等離子對(duì)試劑改善保留性能。然而，離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜性能會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響[20]，導(dǎo)致質(zhì)譜對(duì)負(fù)離子的分析性能降低，即分析氨基糖苷類藥物用的質(zhì)譜將只能用于正離子測定，這也是目前該類藥物分析面臨的最大困難。因此，不采用離子對(duì)試劑作為流動(dòng)相組分的親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）逐漸成為氨基糖苷類等極性物質(zhì)分析研究的熱點(diǎn)。本研究通過對(duì)不同鍵合相的親水作用色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立動(dòng)物源性食品中10 種氨基糖苷類藥物殘留量的檢測方法，克服常規(guī)方法損傷質(zhì)譜的缺陷，提高方法的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用的豬肉、牛肉、豬腎和牛肝均為天津口岸進(jìn)出口的日常檢測樣品。

乙腈、甲酸（色譜純）：德國Merck 公司；三氯乙酸、七氟丁酸、庚烷磺酸鈉（分析純）：Sigma-Aldrich 公司（美國）；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetate dehydrate，EDTA-2Na）、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（分析純）：天津試劑公司；丁胺卡那霉素、潮霉素B、奇霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、新霉素、安普霉素、妥布霉素和慶大霉素（純度大于99%）：Dr.E hretorfer GmbH 公司。試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200-API 4000 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：AB Sciex 公司；Sielc Obelisc R 色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）：飛諾美公司；ACQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：沃特世公司；GL Sciences InertSustain Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）：島津（上海）試驗(yàn)器材有限公司；TSKgel Amide-80 色譜柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）：東曹（上海）生物科技有限公司；IKA HS501 水平往復(fù)振蕩儀、IKA MS3 basic 渦旋混合器：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；Avanti J-30I高速冷凍離心機(jī)：貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；SPE-24 固相萃取裝置：博納艾杰爾科技有限公司；NEVAP-34 氮?dú)鉂饪s儀：organomation 公司。

1.2 樣品預(yù)處理

稱取試樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 含0.4 mmol/L EDTA、2%三氯乙酸的磷酸緩沖液（pH 4.0），振蕩提取10 min，離心取上清，對(duì)殘?jiān)貜?fù)提取1 次，合并兩次提取的上清液，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH 值為3.5，加入2 mL 100 mmol/L 七氟丁酸溶液，渦旋混勻后在預(yù)先經(jīng)3 mL 甲醇、3 mL 去離子水活化的C18 固相萃取柱上樣，然后先用3 mL 20 mmol/L七氟丁酸溶液洗滌，再用水洗滌2 次，每次3 mL，抽干，最后用5 mL 乙腈-20 mmol/L 七氟丁酸溶液（體積比 8 ∶2）洗脫，洗脫液于40 ℃氮吹至小于1 mL，用含4 %甲酸的0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉溶液定容至1 mL，過膜，待測。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：Sielc Obelisc R 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），流速 0.3 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，流動(dòng)相 A 為1%的甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈，流動(dòng)相C 為水，采用梯度進(jìn)行洗脫分離。

梯度洗脫程序如表1 所示。

質(zhì)譜條件：采用正離子掃描模式，噴霧電壓為5 500 V，霧化氣壓力為12 psi（1 psi=0.006 89 MPa），氣簾氣壓力為20 psi，輔助氣1 壓力為55 psi，輔助氣2壓力為50 psi，離子源溫度為600 ℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式。

10 種氨基糖苷類藥物的定性定量離子對(duì)等信息見表2。

表2 10 種氨基糖苷類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS paramaters for 10 aminoglycosides

續(xù)表2 10 種氨基糖苷類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Continue table 2 MS paramaters for 10 aminoglycosides

2 結(jié)果與分析

2.1 親水作用色譜柱的選擇

一般認(rèn)為，親水作用色譜的保留機(jī)制主要包括鍵合固定相水層和流動(dòng)相之間的分配作用、氫鍵或偶極之間的吸附作用以及靜電作用[21-22]。親水作用色譜的鍵合固定相種類繁多，包括未衍生的硅膠以及氨基、酰胺基、氰基修飾的硅膠等[23]。不同的鍵合固定相在分離目標(biāo)物的過程中往往保留機(jī)制迥異，需要通過具體的試驗(yàn)進(jìn)行選擇。本試驗(yàn)主要對(duì)ACQUITY UPLC BEH HILIC 柱（鍵合相為硅膠）、GL Sciences InertSustain Amide（鍵合相為酰胺基）柱、TSKgel Amide-80（鍵合相為酰胺基）柱和Sielc Obelisc R（鍵合相為含電荷的極性和非極性混合基團(tuán)）色譜柱分離氨基糖苷類藥物的效果進(jìn)行了比較。

潮霉素B、安普霉素和新霉素在3 種色譜柱上的分離色譜圖見圖1。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，BEH HILIC 柱分離氨基糖苷類藥物效果不佳，其余3 種色譜柱可以對(duì)目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)分離。其中InertSustain Amide 柱在流動(dòng)相含100 mmol/L 甲酸銨的條件下以乙腈和水可以實(shí)現(xiàn)氨基糖胺類物質(zhì)的分離，但潮霉素B、奇霉素會(huì)出現(xiàn)雙峰，目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度相應(yīng)較弱。而TSK gelAmide-80 柱和Sielc Obelisc R 鍵合相的親水作用色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離較為相似，采用1%甲酸水和乙腈為流動(dòng)相的條件下可以實(shí)現(xiàn)氨基糖苷類藥物的分離。TSKgel Amide-80 柱上目標(biāo)物質(zhì)雖為單一峰形，但峰形有展寬，且拖尾，而含有陽離子極性與非極性混合作用機(jī)理模式的Sielc O－belisc R 色譜柱上各物質(zhì)的分離效果最好。故最終采用Sielc Obelisc R 色譜柱。

圖1 潮霉素B、安普霉素和新霉素在3 種色譜柱上的分離圖Fig.1 Separation of hygromycin B，apramycin and neomycin in different column

2.2 流動(dòng)相pH值的優(yōu)化

氨基糖苷類藥物包含多個(gè)氨基結(jié)構(gòu)，屬于堿性糖苷，因此在與Sielc Obelisc R 柱填料相互作用的過程中，流動(dòng)相的pH 值會(huì)顯著影響氨基糖苷類物質(zhì)的電荷狀態(tài)，進(jìn)而影響其在色譜柱上受到的靜電作用的大小，導(dǎo)致分離性能出現(xiàn)差異[24]。本研究分別比較了0.1%甲酸水，0.5 %甲酸水和1 %甲酸水對(duì)于目標(biāo)物分離的影響。

妥布霉素在不同甲酸含量流動(dòng)相中的分離情況見圖2。

由圖2 可知，1%甲酸水作為流動(dòng)相的效果最佳。這是由于流動(dòng)相的pH 值越低，堿性的氨基糖苷類藥物Sielc Obelisc R 柱填料表面均帶正電荷，存在排斥作用，避免了因靜電吸引而導(dǎo)致的峰形拖尾，同時(shí)保留時(shí)間也明顯縮短。試驗(yàn)中，InertSustain Amide 柱和TSKgel Amide-80 柱在1%甲酸水的條件下拖尾現(xiàn)象也有所改善，但峰整體展寬很嚴(yán)重，說明酰胺基的鍵合相對(duì)目標(biāo)物的吸附作用更強(qiáng)，不易洗脫。

2.3 HILIC色譜柱分析穩(wěn)定條件的探索

圖2 流動(dòng)相pH 值對(duì)親水作用色譜分離氨基糖苷類藥物的影響Fig.2 The effect of pH value of mobile phase during the separation of aminoglycosides using HILIC column

一些文獻(xiàn)[21-25]顯示，HILIC 機(jī)制的色譜柱在使用過程中往往存在保留時(shí)間不穩(wěn)定的情況，本研究也對(duì)氨基糖苷類藥物在HILIC 柱上分析的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，HILIC 柱需要比常規(guī)反相色譜柱更長的平衡時(shí)間，一旦流動(dòng)相條件發(fā)生變化，至少需要進(jìn)行30 min 以上的重新平衡時(shí)間。而且梯度洗脫程序中的平衡時(shí)間也相對(duì)較長，本方法在目標(biāo)物洗脫完成后10 min 才使柱壓恢復(fù)到起始?jí)毫?。此外，HILIC 柱需保持高比例的有機(jī)相，因此每次試驗(yàn)后需及時(shí)將色譜柱從儀器上取下，否則易出現(xiàn)HILIC 柱中有機(jī)相揮發(fā)導(dǎo)致的柱壓上升并進(jìn)而影響分離的情況。鑒于上述原因，本方法的梯度洗脫程序后期采用了近11 min 的平衡時(shí)間，且保證每次使用后及時(shí)將色譜柱兩端封口。在這種條件下，HILIC 柱對(duì)氨基糖苷類藥物的分離效果十分穩(wěn)定。

2.4 凈化柱和定容溶液的優(yōu)化

盡管HILIC 填料固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）柱或定制柱也可用于氨基糖苷類藥物的凈化，但商品化產(chǎn)品相對(duì)較少，定制價(jià)格較高，且洗脫條件隨目標(biāo)物的類別變化而變化，通用性較差，目前國內(nèi)外應(yīng)用相對(duì)較少。鑒于氨基糖苷類藥物強(qiáng)極性和堿性的特征，離子交換柱和C18 柱（配合離子對(duì)試劑）SPE 是文獻(xiàn)中應(yīng)用較多的兩種固相萃取柱。本研究中分別用弱陽離子交換柱（weak cation exchange，WCX）和C18 SPE 柱對(duì)豬肉組織中10 種氨基糖苷類藥物進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素用WCX 柱凈化時(shí)效果較好，但其他7 種物質(zhì)的凈化效果不理想，而C18 SPE 柱在七氟丁酸離子對(duì)和酸性緩沖液的作用下對(duì)10 種氨基糖苷類藥物均能實(shí)現(xiàn)較好的凈化效果。這可能與氨基糖苷類藥物本身帶電荷狀態(tài)受pH 值影響有關(guān)，離子交換作用可能導(dǎo)致部分物質(zhì)與填料發(fā)生較強(qiáng)的作用而不易洗脫，而離子對(duì)試劑存在下，目標(biāo)物在C18 SPE 柱上僅受極性作用，相對(duì)洗脫較為順利。因此，本研究最終采用C18 SPE 柱配合七氟丁酸溶液進(jìn)行凈化處理。

對(duì)于定容溶液的選擇，試驗(yàn)中比較了七氟丁酸和庚烷磺酸鈉溶液，結(jié)果顯示庚烷磺酸鈉定容后氨基糖苷類藥物的色譜分離效果更好。

2.5 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線采用空白豬肉基質(zhì)提取液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的方式配制，再以親水作用色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，計(jì)算擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果顯示，以測定結(jié)果的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，分析物的濃度（x）為橫坐標(biāo)，10 種氨基糖苷類藥物在50 ng/mL～5 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。同時(shí)，通過在空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)測定，以提取離子色譜峰的信噪比（S/N）大于10 計(jì)算方法的定量限[26]：新霉素、潮霉素B 和安普霉素為100 μg/kg，奇霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素為20 μg/kg，可以滿足目前國內(nèi)外對(duì)氨基糖苷類藥物的最大殘留限量的要求。

10 種氨基糖苷類物質(zhì)的提取離子色譜圖見圖3。

由圖3 可以看出，10 種氨基糖苷類藥物可在本研究條件下獲得很好的分離，并且峰形尖銳。

圖3 10 種氨基糖苷類藥物經(jīng)親水作用色譜柱分離的提取離子色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of ten aminoglycosides separated by HILIC column

2.6 回收率和精密度

在空白的豬肉、牛肉、豬腎和牛肝樣品中添加20、40、200 μg/kg 的丁胺卡那霉素、奇霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素和100、200、1 000 μg/kg 的新霉素、潮霉素B 和安普霉素，以各自的定量離子對(duì)進(jìn)行定量。

豬肉、牛肉、豬腎和牛肝中10 種氨基糖苷類藥物的添加回收率和精密度的結(jié)果見表3。

表3 的結(jié)果顯示，在豬肉、牛肉、豬腎和牛肝中分別添加1 倍、2 倍和10 倍定量限的10 種氨基糖苷類藥物的檢測回收率為73.9%～103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～14.8%，可以滿足分析檢測的需要。

表3 不同基質(zhì)中10 種氨基糖苷類藥物的添加回收和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of ten aminoglycosides spiked in different matrices（n=6）

3 結(jié)論

本研究針對(duì)質(zhì)譜分析氨基糖苷類藥物時(shí)的常規(guī)反相色譜無法有效分析目標(biāo)物的缺陷，通過4 種HILIC 機(jī)理色譜柱的比較和流動(dòng)相及凈化定容溶液的優(yōu)化，建立了動(dòng)物源食品中10 種氨基糖苷類藥物殘留量檢測的親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。雖然親水作用色譜體系中的相互作用機(jī)制較為復(fù)雜，需要針對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行流動(dòng)相和預(yù)處理方法的反復(fù)調(diào)整，但與常規(guī)的反相色譜體系相比，本方法避免在流動(dòng)相中使用大量離子對(duì)試劑，利于質(zhì)譜檢測。本方法的靈敏度高，重現(xiàn)性好，適于推廣。