T-2毒素快速定量檢測試紙條的研究

許會靜，李玉杰，張馨月，王弘瑞，苗茁，柳玉，李艷，王會巖，董媛，*

（1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，黑龍江吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學院抗體中心，黑龍江吉林132013）

T-2 毒素屬于A 型單端孢霉烯族化合物，主要由三線鐮刀菌、枝孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、硫色鐮刀菌等真菌代謝產生[1]。在寒冷或潮濕的儲存條件下，燕麥、玉米、大麥、小麥和動物飼料等易被污染。T-2 毒素可以抑制蛋白質[2]和核酸[3]的合成，人類誤食污染的谷物后，表現(xiàn)出一系列急性和慢性的中毒癥狀，如嘔吐、腹瀉、昏睡、體重減輕、出血、免疫抑制，甚至死亡[4-5]。目前研究表明，人類食物中毒性白細胞缺乏癥和大骨節(jié)病[6]也與該毒素相關。T-2 毒素性質穩(wěn)定，可在動物體內代謝和消除，產生比其本身毒性更強的代謝產物[7]。目前仍沒有有效的解毒方法進行治療。因此，為避免T-2 毒素的污染，減少其對人類和畜牧業(yè)的危害，建立快速、靈敏、準確地檢測T-2 毒素的方法已成為近年來研究的熱點。

目前，氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8]、氣相色譜串聯(lián)質譜法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）[9]，高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[10]、液相色譜串聯(lián)質譜法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）[11]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[12-13]等技術已經廣泛應用到T-2 毒素的檢測中。但是，這些傳統(tǒng)的檢測方法操作繁瑣，需要昂貴的儀器，專業(yè)的技術人員等，不但成本高，而且分析速度慢，難以達到快速、簡便和現(xiàn)場檢測要求。膠體金免疫層析技術（colloidal gold immunochromatography，GICA）具有高靈敏度、低成本、操作簡便、結果判斷直觀等優(yōu)點，已廣泛應用于T-2 毒素的快速檢測、臨場檢測等領域，但目前該試紙條只能做定性檢測[14-15]。本試驗制備出T-2 毒素單克隆抗體，根據(jù)膠體金免疫層析試驗原理，結合定量讀卡儀，建立一種快速定量檢測T-2 毒素的膠體金試紙條，并在玉米檢測中進行應用，為真菌毒素的快速檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Balb/c 小鼠（6 周～8 周雌性）：吉林大學動物實驗中心；T-2 毒素、HT-2 毒素、新石房蛤毒素（neosaxitoxin，NEO）、蛇形霉素（diacetoxyscirpenol，DAS）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素（deoxynivalenol，DON）、雪腐鐮刀菌烯醇毒素（nivalenol，NIV）標準溶液：普瑞邦生物工程有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：合肥博美生物科技有限責任公司；30 nm 膠體金、NC 膜、玻璃纖維膜、PVC底板：上海杰一生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

點膜儀（XYZ3000）：Bio-Dot 公司；數(shù)控切條機（CT-300）：上海金標生物科技有限公司；分析型高效液相色譜儀（2695 分析型）：美國waters 公司；酶標分析儀（SM-3 型）：北京天石天力醫(yī)療器械技術開發(fā)中心；紫外-可見分光光度計（Nanodrop2000）：美國 Thermo 公司；膠體金定量讀數(shù)儀（TND09MJ）：深圳拓能達科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 T-2 毒素單克隆抗體的制備

參考Chu 等[16-17]的方法合成T-2-HG-BSA 和 T-2-HS-OVA 抗原，以 T-2-HG-BSA 為抗原對 6 周～8 周的雌性Balb/c 小鼠進行免疫，4 次免疫后取小鼠免疫血清ELISA 測定效價，選擇血清效價高的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞（SP2/0）進行融合，獲得T-2 毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株，將其接種到Balb/c 小鼠腹腔內采集腹水，得到T-2 毒素單克隆抗體，并采用間接ELISA法對抗體的效價進行測定。

1.3.2 T-2 毒素單克隆抗體的純化鑒定

將小鼠腹水與20 mmol/L 磷酸鈉溶液混合，平衡8 h 后過protein G 純化柱純化，最后用甘氨酸鹽酸洗脫液沖洗柱子，收集洗脫液并在PBS（0.01 mmol/L，pH 7.2）中透析24 h，得到純化后的T-2 毒素單克隆抗體。將純化后的抗體進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳鑒定。

1.3.3 膠體金標記抗體最適pH 值的確定

取酶標板，加入100 μL 膠體金后，用0.1 mol/L HCl和 K2CO3溶液，調節(jié) pH 值分別為 6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 和 9.5，混勻后加入 4 μL T-2 毒素抗體（1 mg/mL，混勻后加入 10 % NaCl 20 μL，30 min 后觀察標記結果，測定 OD520值。

1.3.4 金標抗體的制備

取膠體金溶液1 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液調節(jié)膠體金溶液（30 nm）至最佳pH 值，在溫和攪拌條件下，向其中逐滴加入20 μL T-2 毒素單克隆抗體（1.0 mg/mL），充分混勻 30 min 后，加入 40 μL 濃度為10%BSA 封閉15 min，加入終濃度為0.1%PEG20000混勻15 min。將上述標記后的膠體金溶液1 500 r/min低速離心20 min；取上清再12 000 r/min 高速離心20 min；重懸沉淀于儲存液中，4 ℃保存?zhèn)溆?。紫外條件下全波長掃描標記抗體的膠體金溶液和未標記的膠體金溶液，觀察掃描圖譜波形變化，判斷標記是否成功。

1.3.5 抗體最佳標記濃度和抗原最佳包被濃度

在確定最佳pH 值條件下，單抗分別按照5、10、20、30 μg/mL 標記，均勻噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金結合墊，T-2-HS-OVA 抗原按照 0.125、0.25、0.5、0.75 mg/mL 分別包被在 NC 膜上的檢測線（T 線），羊抗鼠二抗按 1.0 mg/mL 包被到 NC 膜的質控線（C 線），將膠體金結合墊、樣品墊和吸水墊按順序組裝在底板上，進行正交試驗，檢測T-2 毒素標準溶液（0、2、5、10、20、50 μg/kg）濃度，選擇 0 μg/kg 顯色明顯且靈敏度高的組合為最佳條件。在此條件下，羊抗鼠二抗按0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL 包被到 NC 膜的 C 線，選擇檢測10 μg/kg 標準溶液時C 線顯色強度與T 線相當?shù)陌粷舛葹闉樽罴褩l件。

1.3.6 快速檢測卡的組裝與檢測

用PBS 配置5%蔗糖、0.05%tween-20 溶液的處理液，玻璃纖維塑膜浸入處理液，10 min 后25 ℃室溫晾干。將最佳標記量的金標抗體均勻噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金結合墊，37 ℃干燥1 h。將T-2-HSOVA 抗原和二抗，分別用包被于NC 膜上的T 線和C線，37 ℃干燥2 h。將膠體金結合墊、樣品墊和吸水墊按順序組裝在底板上，并切割裝入塑料卡殼中，制成檢測卡。在檢測卡的加樣孔中滴加50 μL 待檢樣品溶液，2 min 后，放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取濃度值。

1.3.7 標準曲線的建立

配制不同濃度（0、5、10、20、50、100 μg/kg）的 T-2毒素標準溶液，分別取50 μL 加到檢測卡的加樣孔中，25 ℃室溫反應2 min，放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取T 線光密度/C 線光密度比值（T/C），T-2 標準品濃度為0 μg/kg 時 T/C 記為 B0，不同濃度 T-2 標準溶液 T/C 記為B，以T-2 毒素標準溶液濃度的對數(shù)為橫坐標、B/B0值為縱坐標，制作標準曲線。

1.3.8 樣品前處理方法的確定

稱取粉碎的玉米樣品5 g，加入25 mL70%甲醇水溶液，漩渦震蕩提取3 min，提取液用雙層濾紙過濾，取1 mL 濾液加入到 4 mLPBS（0.01 mol/L）溶液中進行5倍稀釋，樣品稀釋液用有機相濾膜（0.45 μm）過濾，取出該濾液50 μL 滴入檢測孔進行檢測，2 min 后放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取濃度值。

1.3.9 回收試驗

取玉米樣品，檢測其中T-2 毒素含量，向其中添加不同濃度的（5、10、20、50、100 μg/kg）T-2 毒素標準溶液，再次進行檢測，計算回收率。

1.3.10 特異性檢測

用 PBS 稀釋 T-2 毒素、HT-2 毒素、NEO、DAS、DON、NIV 標準溶液至終濃度為 200、400、800、1 600、3 200 μg/L，用T-2 毒素快速檢測試紙條進行檢測，每個濃度設6 個重復，檢測試紙條的特異性。

1.3.11 重復性檢測

隨機抽取3 個不同批次及同一批次的試紙條，檢測不同質量濃度的（5、10、20、50、100 μg/kg）T-2 毒素標準溶液，每個樣本濃度重復測定5 次，檢查試紙條的重復性。

1.3.12 樣品檢測

取10 份玉米樣品，向其中隨機添加不同濃度的T-2 毒素標準溶液，制備T-2 毒素含量在5 μg/kg～100 μg/kg 之間的玉米樣品，分別用試紙條和高效液相色譜法[18]進行檢測，每個樣品重復3 次，并將檢測結果進行對比。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2007 進行統(tǒng)計分析和標準曲線制作，數(shù)據(jù)以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 T-2單克隆抗體效價的測定

采用間接ELISA 方法測定T-2 單克隆抗體效價，單克隆抗體的效價為1 ∶256 000。

2.2 T-2毒素單克隆抗體的純化鑒定

T-2 毒素單克隆抗體經protein G 純化后通過SDS-PAGE 電泳進行鑒定，結果顯示（如圖1），50 kDa和25 kDa 位置有清晰條帶，且未見雜蛋白，表明純化得到純度較高的T-2 毒素單克隆抗體。

2.3 膠體金標記抗體最適pH的確定

物理吸附是膠體金與蛋白質結合的主要機制。膠體金顆粒表面的負電荷與蛋白表面正電荷通過靜電作用相互吸附，因此標記溶液的pH 值對蛋白標記成功與否有重要作用。如圖2 所示。

圖1 T-2 抗體純化后的SDS-PAGE 電泳鑒定結果Fig.1 Identification of T-2 antibody purification by SDS-PAGE

圖2 T-2 毒素金標抗體最佳pH 的確定Fig.2 Optimal pH of T-2 toxin colloidal antibody

由圖2 可知，當pH 值為8.5 時，膠體金標記抗體蛋白結合物在520 nm 處的吸光值較高，且曲線趨于平坦，標記抗體未發(fā)生死金現(xiàn)象，表明膠體金記抗體的最佳pH 值為8.5。

2.4 金標抗體的質量鑒定

紫外條件下全波長掃描標記抗體的膠體金溶液和未標記的膠體金溶液，結果見圖3。

圖3 膠體金掃描圖譜Fig.3 Colloidal gold scanned pattern

由圖3 可見，標記T-2 毒素單克隆抗體的膠體金溶液最大吸收峰出現(xiàn)了明顯的位移，因此可判斷抗體被膠體金成功標記。

2.5 抗體最佳標記濃度和抗原最佳包被濃度

通過正交試驗，單抗的最佳標記濃度為20 μg/mL標記，抗原的包被濃度為0.5 mg/mL，羊抗鼠IgG 的包被濃度為1.0 mg/mL，為最佳組合條件，此時試紙條的最低檢測限為5 μg/kg。

2.6 標準曲線的建立

通過檢測不同濃度的T-2 毒素標準溶液，膠體金讀數(shù)儀讀取T 線光密度/C 線光密度比值（T/C），以T-2毒素標準溶液濃度的對數(shù)為橫坐標、B/B0值為縱坐標，制作標準曲線。T-2 毒素標準溶液濃度在10 μg/kg～100 μg/kg 時，線性范圍較好。其線性方程和回歸系數(shù)見圖4。

圖4 膠體金試紙條法檢測T-2 毒素的標準曲線Fig.4 Standard curve for detection of T-2 toxin by colloidal gold strip method

2.7 回收試驗

取玉米樣品，檢測其中T-2 毒素含量，向其中添加不同濃度的T-2 毒素標準溶液，再次進行檢測，計算回收率，結果見表1。

表1 玉米添加T-2 毒素的回收率和變異系數(shù)Table 1 Recoveries and coefficients of variation of T-2 in corn

結果顯示，該試紙條檢測玉米樣本的回收率在77 %～117.6%之間，變異系數(shù)小于10%，表明該檢測方法精密度和重現(xiàn)性良好。

2.8 特異性檢測

用 PBS 稀釋 T-2 毒素、HT-2 毒素、NEO、DAS、DON、NIV 標準溶液至不同濃度，用T-2 毒素快速檢測試紙條進行檢測，評價試紙條的特異性，結果見表2。

表2 T-2 毒素快速檢測試紙條的特異性Table 2 Specificity of T-2 toxin rapid test trip

由表2 可知，T-2 毒素快速檢測試紙條與其他真菌毒素無交叉反應。說明該試紙條有高度的特異性。

2.9 重復性檢測

隨機抽取3 個不同批次及同一批次的試紙條，檢測不同質量濃度的T-2 毒素標準溶液，檢查試紙條的重復性。檢測結果見表3、表4，結果表明，T-2 毒素快速定量檢測試紙條的批內和批間變異系數(shù)均小于10%，表明該檢測方重復性良好。

2.10 方法比對

隨機取 10 份 T-2 毒素含量在 5 μg/kg～100 μg/kg之間的玉米樣品，分別用試紙條和高效液相色譜法進行檢測，并將檢測結果進行對比。結果見圖5，GICA 與HPLC 檢測結果一致。

表3 T-2 毒素快速檢測試紙條的批內重復性Table 3 Intra repetitiveness of T-2 toxin rapid test trip

表4 T-2 毒素快速檢測試紙條的批間重復性Table 4 Inter repetitiveness of T-2 toxin rapid test trip

圖5 GICA 與HPLC 檢測樣品中T-2 毒素結果的比較Fig.5 Correlation of quantitative data of T-2 obtained by GICA and HPLC

3 討論

玉米是我國重要的糧食作物之一，玉米加工食品也是人們日常生活必不可少的，比如玉米面、玉米油、速食玉米等。此外，玉米在工業(yè)方面也有重要作用，比如酒精、飼料、制藥等的加工原料。但隨現(xiàn)代化和工業(yè)化進程的發(fā)展，T-2 毒素的污染對其造成嚴重的質量安全問題[18-20]。世界各國對T-2 毒素都有嚴格的限量標準[21]，檢測玉米中T-2 毒素的含量對避免T-2 毒素的污染，減少其對人類和畜牧業(yè)的危害有重要意義。由于GICA 具有操作簡便，快速，靈敏度的特點，已廣泛應用于多種真菌毒素的檢測中[22-23]。目前，朱亮亮等[14-15]建立的飼料和谷物中T-2 毒素檢測試紙條只能定性不能定量。本試驗建立的T-2 毒素膠體金定量檢測試紙條可以通過定量讀數(shù)儀獲得T-2 毒素的具體含量，避免了人為因素主觀判斷造成的差異。研究表明[13]，半抗原和載體蛋白之間間隔較長碳鏈的免疫原性優(yōu)于間隔較短碳鏈的免疫原性，包被抗原的異質性可提高免疫反應的特異性。因此本實驗室選用比T-2HS-BSA 碳鏈較長的T-2HG-BSA 為免疫原自主制備出了高特異性的抗T-2 毒素單克隆抗體，并進行了膠體金標記，提高了檢測結果的特異性。選用與T-2HS-BSA 具有較高異質性的T-2HS-OVA 為包被抗原噴涂在硝酸纖維膜上，提高了檢測結果的靈敏度。并通過實驗室試紙條檢測參數(shù)的優(yōu)化，把T-2 毒素免疫膠體金快速試紙條檢測限提高到5 μg/kg，明顯高于膠體金標記T-2 毒素多克隆抗體的靈敏度[15]，玉米添加回收率在77%～117.6%之間，批內和批間重復性檢測變異系數(shù)小于10%，玉米中T-2 毒素的檢測結果與高效液相法檢測結果一致。表明本試驗研制的快速定量檢測T-2 毒素的方法，可以有效地對食品中T-2 毒素進行檢測和監(jiān)控，具有重要的經濟價值和社會價值。