糖化攪拌頻率對精釀啤酒性質(zhì)的影響研究

王麗麗，陳浩，劉世永

（1.威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東榮成264300；2.山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東威海264209；3.威海市特色果蔬高值加工工程技術(shù)研發(fā)中心，山東榮成264300）

啤酒是當(dāng)今世界各國的低酒精度銷量最大的飲料，作為啤酒消費(fèi)較大國之一，我國啤酒市場規(guī)模高達(dá)5 000 億元。據(jù)中國報(bào)告網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，在我國2018 全年啤酒產(chǎn)量為445.7 億升。產(chǎn)量規(guī)模雖位居全球前列，但已經(jīng)連續(xù)五年呈下降趨勢，在此趨勢下，精釀啤酒逆勢而上，呈現(xiàn)良好的上升態(tài)勢[1]。這可能是由于隨著人民生活質(zhì)量的提高，市場上口味單一的工業(yè)啤酒已經(jīng)不能像以前那樣滿足消費(fèi)者對啤酒產(chǎn)品的品質(zhì)要求。風(fēng)味濃郁，口感豐富，不添加任何人工添加劑，僅用麥芽、啤酒花、酵母和水等上等原料發(fā)酵而成的高品質(zhì)精釀啤酒滿足了廣大消費(fèi)者的預(yù)期。也有預(yù)測指出：精釀啤酒將是國內(nèi)啤酒市場的未來和趨勢[2]。

精釀啤酒的概念是由美國發(fā)出的，如今在美國，精釀啤酒已經(jīng)成為有精美包裝的可銷售成品，發(fā)展的已經(jīng)比較成熟[3]。中國的精釀啤酒起始于20 世紀(jì)90 年代，只是在小范圍推廣融入當(dāng)?shù)靥厣漠a(chǎn)品，此時(shí)只能稱為啤酒屋，并不是真正意義上的精釀啤酒。后來隨著人們對于高質(zhì)量啤酒的追求，加上來自世界市場的沖擊，2008 年以后才出現(xiàn)一批有意識的精釀企業(yè)[4]，精釀啤酒的工藝及品質(zhì)也逐漸成熟。

糖化過程是啤酒生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，糖化是指利用麥芽本身所含有的各種水解酶在水和熱的作用下，將麥芽和輔料中的不溶性高分子物質(zhì)分解成可溶性的低分子物質(zhì)，從而獲得含有一定量可發(fā)酵性糖、酵母營養(yǎng)物質(zhì)和啤酒風(fēng)味物質(zhì)的麥汁。精釀啤酒釀造時(shí)的糖化工藝分階段升溫和保溫操作，54 ℃下保溫40 min以后，將溫度加熱至65 ℃，保溫60min，每隔10 min 攪拌一次。由于機(jī)械不能定時(shí)自動打開攪拌器，所以在此環(huán)節(jié)必須是工作人員定時(shí)去手動打開攪拌器，這個過程比較消耗勞動時(shí)間。目前對精釀啤酒的研究方向主要還停留在市場調(diào)研[5]、生產(chǎn)安全[6]、功能保健產(chǎn)品工藝研發(fā)和優(yōu)化[7-8]上面。至今還沒有科研工作者對糖化攪拌頻率對精釀啤酒性質(zhì)影響進(jìn)行較為完善的研究。本論文研究糖化攪拌頻率對精釀啤酒理化指標(biāo)、感官指標(biāo)及微生物群落多樣性三方面性質(zhì)的影響，來判斷是否可以減少攪拌次數(shù)，從而節(jié)省人工，以期為全面認(rèn)識精釀啤酒、優(yōu)化發(fā)酵工藝提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司；優(yōu)質(zhì)大麥芽、小麥芽、酒花：市售。

1.2 主要試劑與設(shè)備

NucleoSpin 96 Soil 試劑盒：德國 MN 公司；0.45 μm硝酸纖維素濾膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、鄰苯二胺：均為分析純，國藥控股威海有限公司。CS-2000 粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；HiSeq 2500 高通量測序儀：Illumina 公司；1795 微型離心機(jī)：天根生化科技有限公司；HZ-88 恒溫水浴振蕩器：國旺儀器有限公司；BS2202S 電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FE20 PH 計(jì)：梅特勒-托利多（常州）精密儀器有限公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精釀啤酒生產(chǎn)工藝

糖化工藝自身循環(huán)加熱至65 ℃，保溫60 min 環(huán)節(jié)中攪拌頻率10 min 1 次的為A 組、15 min 1 次的為B 組、30 min 1 次的為C 組，其余工藝和參數(shù)不變，進(jìn)行啤酒的同步獨(dú)立發(fā)酵。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

總酸含量的測定、雙乙酰含量的測定、實(shí)際發(fā)酵度的測定、酒精度的測定分別參考GB/T4928-2008《啤酒分析方法》中的電位滴定法、雙乙酰的測定、真正（實(shí)際）發(fā)酵度的測定、密度瓶法。每組取3 個樣品，每個樣品平行測定2 次。

1.3.3 感官分析

參考GB/T4927-2008《啤酒》濃色啤酒感官要求，從啤酒外觀、泡沫的形態(tài)和泡持性、香氣、口味4 個維度進(jìn)行分析，由威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系啤酒發(fā)酵實(shí)訓(xùn)室的老師及相關(guān)人員24 人組成評定小組，采用雙盲法方法對啤酒進(jìn)行打分，評價(jià)之前對評價(jià)員進(jìn)行培訓(xùn)，解說評定指標(biāo)。評價(jià)過程中，評價(jià)員之間不允許交流。啤酒感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 啤酒感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Tasting items and scoring criteria for original craft beer

1.3.4 微生物群落多樣性分析

從A、B、C 樣品中各取800 mL 啤酒，取出后立即用硝酸纖維素濾膜進(jìn)行真空抽濾，富集菌體，帶有富集菌體的干燥濾膜剪碎或折疊后保存在5 mL 無菌離心管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用NucleoSpin 96 Soil 試劑盒提取樣品總DNA 后，根據(jù)真菌可變區(qū)（ITS1）設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測序接頭，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用HiSeq 2500 進(jìn)行測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，以A 組與B 組、C 組之間差異顯著性采用單因素方差分析法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與A 組相比，P<0.05 為顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

精釀啤酒成熟原漿理化分析結(jié)果見表2。

表2 精釀啤酒成熟原漿理化分析結(jié)果Table 2 Physical and chemical analysis results of original craft beer

啤酒中所含酸類可達(dá)200 種以上，這些酸及其鹽控制著啤酒的總酸含量和pH 值。在GB/T4927-2008中啤酒總酸含量要求低于2.6 mL/100 mL。在啤酒發(fā)酵過程中，雙乙酰是酵母合成纈氨酸的中間產(chǎn)物，由α-乙酰乳酸氧化生成，是啤酒中重要的副產(chǎn)物，其含量直接影響啤酒的風(fēng)味[9]。啤酒的實(shí)際發(fā)酵度指麥汁中浸出物被酵母消耗掉部分與麥汁中浸出物總量之比。啤酒發(fā)酵過程中必須要把發(fā)酵度控制在一個合理的范圍內(nèi)[10]。若啤酒發(fā)酵度較低，則說明殘?zhí)橇扛?，啤酒發(fā)酵液容易滋生雜菌而被污染，若啤酒發(fā)酵度比較高，則說明發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行的比較充分，生成的酒精和二氧化碳濃度較高，會對啤酒質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。同實(shí)際發(fā)酵度類似，啤酒的酒精含量也要控制在一個合理的范圍內(nèi)。

如表2 所示，在總酸含量上，A 與 C，B 與 C，C 與A、B，這些之間具有顯著的差異性（P<0.05）。A 與 B 之間不存在顯著的差異性（P>0.05）。在雙乙酰含量上各組間不存在顯著的差異性（P>0.05）。在實(shí)際發(fā)酵度上，A 與 C 之間具有顯著的差異性（P<0.05），A 與 B，B 與C 之間不存在顯著的差異性（P>0.05）。在酒精度上，A與 C 之間具有顯著的差異性（P<0.05），A 與 B，B 與 C之間不存在顯著的差異性（P>0.05）。攪拌頻率對啤酒原漿的總酸含量、雙乙酰含量、實(shí)際發(fā)酵度及酒精度有一定的影響，但是整體來看每隔10 min 攪拌一次和每隔15 min 攪拌一次，差異不顯著（P>0.05）。

2.2 感官評價(jià)分析

精釀啤酒成熟原漿各感官指標(biāo)評價(jià)得分見圖1。

圖1 精釀啤酒成熟原漿各感官指標(biāo)評價(jià)得分Fig.1 Sensory score of original craft beer

精釀啤酒未進(jìn)行過濾處理，酒體中有大量的有益于人體的微生物，在視覺上樣品的酒體帶有光澤感，且有肉眼可觀察到的微細(xì)懸浮物。傾倒時(shí)有潔白細(xì)膩的泡沫，掛杯持久不易破碎，且喝完之后杯子上面仍留有部分泡沫，這與工業(yè)啤酒有比較大的區(qū)別，工業(yè)啤酒的泡沫釋散的比較快，且容易破碎，這可能與啤酒在釀造過程中用到的酒花、麥芽的數(shù)量有較大的關(guān)系。精釀啤酒在原料上只選用麥芽、酵母、酒花和水作為基料。有的工業(yè)啤酒為減少原料成本和控制啤酒的穩(wěn)定性，會加入玉米、淀粉和酶制劑。精釀啤酒的泡沫由泡沫蛋白質(zhì)，多肽物質(zhì)和異草酮三大要素組成[11]。啤酒中這3 種成分的含量及比例決定了泡沫的形態(tài)、掛杯時(shí)長等性質(zhì)。精釀啤酒麥芽香氣比較明顯，品嘗起來口味純正，爽口，酒體醇厚，殺口，柔和，無異味。啤酒的風(fēng)味物質(zhì)很復(fù)雜，有高級醇、醛類、酸類、酯類、含硫化合物及酒花溶出物等，影響因素也比較多，原料、設(shè)備、配方及發(fā)酵工藝都會直接影響啤酒的香氣和口味。在外觀上，A 與B，A 與C 之間具有顯著的差異性（P<0.05），B 與 C 之間不存在顯著的差異性（P>0.05）。在泡沫指標(biāo)上，A 與B 之間不存在顯著的差異性（P>0.05），C 與 A、B 之間具有顯著的差異性（P<0.05）。B的香氣得分最高，但三者之間不存在顯著的差異性（P>0.05）?？谖渡螩 得分最低，與A，B 之間存在顯著差異性（P<0.05）。

但整體看評價(jià)得分，3 種攪拌頻率下的精釀啤酒原漿的感官品質(zhì)都較好。

2.3 微生物群落多樣性分析

啤酒發(fā)酵中微生物的數(shù)量和種類直接關(guān)系到產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)量。目前已知的是在啤酒發(fā)酵過程中接種啤酒酵母。也就是說啤酒微生物屬于真菌界，真菌群落結(jié)構(gòu)和相互作用機(jī)理比較復(fù)雜。運(yùn)用采用16S rDNA 序列分析啤酒樣品微生物進(jìn)行分子鑒定，通過序列分析進(jìn)行界、門、綱、目、科、屬、種的鑒定。

2.3.1 稀釋曲線

圖2 為稀釋曲線。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of samples

注：橫坐標(biāo)為隨機(jī)抽取的測序條數(shù)，縱坐標(biāo)為基于該測序條數(shù)聚類得到的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數(shù)量，即在測序中按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，每一個OTU 通常被視為一個微生物物種，圖2 中每條曲線代表一個樣品，用不同符號標(biāo)記。

從稀釋曲線可以看出，隨著測序數(shù)量的增加，在0～20 000 的測序數(shù)量范圍內(nèi)，曲線隨著測序條數(shù)表現(xiàn)為上升狀態(tài)，說明隨著測序數(shù)量的增加，精釀啤酒原漿樣品中有大量微生物種類被發(fā)現(xiàn)，在20 000～60 000的測序數(shù)量范圍內(nèi)，稀釋曲線趨于平緩，說明該樣品中的微生物種類不會再隨著測序數(shù)量的增加而顯著增多。該稀釋曲線說明本試驗(yàn)樣品序列充分，能夠反映出樣品中絕大多數(shù)的微生物群落信息，即使再增加測序數(shù)量也不會產(chǎn)生新的OTU。

2.3.2 Alpha 多樣性分析

對于菌群分析而言，樣品中菌群的多樣性可以通過多種指標(biāo)來共同反映。如Chao1、Ace、香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)。其中Chao1 和Ace 指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)用于衡量物種多樣性，香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)值越大，表明菌群豐度越高；辛普森多樣性指數(shù)值越大，表明樣品的菌群均勻度越高[12]。Alpha 多樣性分析見表3。

表3 Alpha 多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of samples

由表3 可以看出，樣品的香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)均小于7 且數(shù)據(jù)差異不顯著，說明3 種攪拌頻率糖化釀造的啤酒菌群的多樣性水平較低[13-14]。

2.3.3 OTUs 數(shù)目統(tǒng)計(jì)及物種注釋分析

在97%的相似度水平下，共得到37 個OTUs。對OTU 進(jìn)行去低含量篩除，原始OTU 聚類結(jié)果中可能含有極低豐度的OTU（物種豐度小于0.005 %），得到最終的OTU 列表并統(tǒng)計(jì)出各樣品中各等級的注釋到物種的Tags 數(shù)如表4 所示，樣品各等級物種統(tǒng)計(jì)表見表5。

表4 樣品各等級Tags 數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 4 Statistical table of Tags of various levels of samples

如表4～表5 所示，啤酒樣品在不同等級Tags 數(shù)量，在門水平上，啤酒平均Tags 數(shù)為65 980，在屬水平上，Tags 數(shù)平均為65 881。從表5 樣品各等級物種數(shù)統(tǒng)計(jì)可以看出，精釀啤酒的微生物多樣性水平，在門水平上的物種數(shù)量為2 個，屬水平上為13～14 個，對比白酒、黃酒等傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，精釀啤酒成熟原漿微生物物種組成比較簡單，這可能是因?yàn)榘拙芠15-17]、黃酒[18]、豆醬[19]等傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品為酒曲發(fā)酵而成，物種組成較為豐富。從樣品屬水平數(shù)據(jù)可以看出，3 種樣品的微生物多樣性整體水平較低，且無顯著性差異（P>0.05）。

表5 樣品各等級物種統(tǒng)計(jì)表Table 5 Statistical table of species in different grades of samples

2.3.4 基于種水平的菌落結(jié)構(gòu)分析

圖3 從種水平（只顯示豐度水平前十的物種）描述了3 種精釀啤酒原漿成熟后微生物菌群結(jié)構(gòu)。

圖3 種水平上的物種相對豐度圖Fig.3 Relative abundance in species level

從圖3 中可以看出，3 種糖化攪拌頻率下釀造出來的精釀啤酒微生物種類上沒有差異，微生物物種含量有差異，但整體排名不受影響。3 種啤酒原漿中膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）所占比例均為最大，其次按照含量降序依次為釀酒酵母（Saccharomyces cerebisiae）、海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）、生絲畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）[20]、丘陵假絲酵母（Candida apicola）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）等。

3 結(jié)論

綜上所述，糖化攪拌頻率對原漿理化性質(zhì)有影響，但是每隔15 min 攪拌一次和每隔10 min 攪拌一次，數(shù)據(jù)差異不顯著。3 種攪拌頻率對感官性質(zhì)和微生物多樣性影響不顯著，因此生產(chǎn)中可以將攪拌頻率設(shè)置為每隔15 min 攪拌一次。本試驗(yàn)對糖化攪拌頻率對精釀啤酒成熟原漿的性質(zhì)進(jìn)行理化、感官及微生物多樣性多方面的影響進(jìn)行了綜合研究，可以為精釀啤酒工藝的改進(jìn)、品質(zhì)的優(yōu)化提供一定的理論基礎(chǔ)。