雙響應值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合γ-氨基丁酸富集技術研究

張良晨，李東紅，于淼，劉曉晶

（1.遼寧省農業(yè)科學院食品與加工研究所，遼寧沈陽110161；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧錦州121013；3.遼寧省疾病預防控制中心，遼寧沈陽110005）

糙米在發(fā)芽過程中由于內源酶的激活富集了一些對人體有特殊功效的功能因子，如六磷酸肌醇、谷維素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、阿魏酸、谷胱甘肽等，其中以GABA 最為引人關注[1]。GABA是一種非蛋白質類氨基酸，在各類生物體內均有分布[2]，它是生物三羧酸循環(huán)中支路反應的中間產物[3]。在植物體內GABA 的作用是調控植物的生長發(fā)育，保證碳源與氮源的穩(wěn)定及信號的傳遞，在植物種子發(fā)芽過程中會成倍增加[4-6]。GABA 對于人體有著重要的生理作用，可以通過調節(jié)人體中樞神經系統(tǒng)，達到降低血壓，舒緩血管的作用，醫(yī)學臨床試驗已經證明，GABA 可以抑制腫瘤細胞中端粒酶的活性，從而控制腫瘤細胞增殖惡化，達到抗癌、抗腫瘤的功效[7]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽糙米的GABA 的含量對比于糙米原料可以增長 2 倍～3 倍，是精白米的 10 倍[8]。

糙米原料帶菌情況復雜，在發(fā)芽糙米生產過程中極易受到腐敗微生物的侵染，使發(fā)芽糙米產品帶上令人不愉快的氣味。目前，主要采用的方抑菌方法是在糙米浸泡液中加入化學殺菌劑，在發(fā)芽糙米干燥前用大量的清水沖洗[9-10]，此種方法耗水量大、成本高、并且存在食品安全問題。脈沖強光殺菌技術起源于上世紀70年代，它利用瞬時、高強度的脈沖形式光能殺滅食品表面各類微生物[11]，它是一種物理殺菌方法，具有高效節(jié)能、易于實現(xiàn)機械化、自動化，無二次污染等優(yōu)點，在食品領域已經應用于乳制品等包裝的表面殺菌[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)通過脈沖強光的照射能夠大大增強植物種子中谷氨酸脫羧酶的活性[14]，谷氨酸脫羧酶是植物中催化谷氨酸生成GABA 的內源酶[15]，糙米中谷氨酸脫羧酶活性的增強能夠大大增加發(fā)芽糙米GABA 的富集量，對比于未經脈沖強光照射的發(fā)芽糙米，其GABA 的富集量可增長30%以上[16]。因此將脈沖強光殺菌技術應用于發(fā)芽糙米生產中不僅能夠殺滅污染發(fā)芽糙米的腐敗微生物，而且能夠達到富集GABA 的目的。本研究在單因素試驗的基礎上，以脈沖強光光照強度、照射次數(shù)、照射距離為響應因素，以發(fā)芽糙米滅菌率、GABA 富集量為響應值，采用響應面雙響應值聯(lián)合分析法探討發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集技術，以期為脈沖強光技術應用于發(fā)芽糙米生產提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糙米：鹽豐 47（GABA 含量為 46.07 mg/100 g），中稻股份有限公司。

1.2 試驗試劑

GABA 標準品：Sigma 公司；營養(yǎng)培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；次氯酸鈉、重蒸苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼砂、無水乙醇均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗設備

BSA124S 電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；QC200 恒溫水浴鍋、80-1 型離心機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV1200 型紫外可見分光光度計：上海正慧工貿有限公司；WI6086 型打漿機：西儀科技有限公司；XMT-152A 型電烘箱：溫州龍興機械廠；LDZX-30FA型滅菌鍋：蘇州奇樂電子科技有限公司；SW-CJ-lF 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 發(fā)芽糙米的制備

參考袁建等[17]的方法，并加以改進。浸泡溫度30℃，浸泡液pH5.5，浸泡時間12 h，發(fā)芽溫度32 ℃，發(fā)芽時間24 h。

1.4.2 發(fā)芽糙米脈沖強光處理

發(fā)芽糙米受腐敗微生物侵染主要發(fā)生在糙米浸泡階段[18]，在糙米浸泡吸水飽和后進行脈沖強光處理。

1.4.3 糙米發(fā)芽微生物測定

采用范軍等[19]的方法。

1.4.4 GABA 含量測定

糙米浸泡后進行脈沖強光處理，按1.4.1 方法發(fā)芽后測定GABA 含量，測定方法采用蔣靜等[20]的方法。

1.4.5 發(fā)芽糙米GABA 富集量計算

發(fā)芽糙米GABA 富集量=發(fā)芽糙米GABA 含量-糙米原料GABA 含量。

1.4.6 單因素試驗

以脈沖強光對發(fā)芽糙米的滅菌率以及通過脈沖強光處理后發(fā)芽糙米的GABA 富集量為考察目標，以脈沖強光的光照強度、照射次數(shù)、照射距離為自變量進行單因素試驗，考察脈沖強光各因素對于發(fā)芽糙米的滅菌率與GABA 富集效果。光照強度設定0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 kJ，照射次數(shù)設定 200、250、300、350、400、450 次，照射距離設定 8、9、10、11、12、13 cm。

1.4.7 響應面雙響應值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA富集工藝

在單因素試驗的基礎上以滅菌率、GABA 富集量為響應值，進行響應面試驗，因素水平見表1。

表1 響應面試驗水平因素表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.4.8 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 脈沖強光處理單因素試驗

2.1.1 光照強度對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響

脈沖強光光照強度對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA富集量的影響見圖1。

圖1 脈沖強光光照強度對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA 富集量的影響Fig.1 The effects of irradiation intensity of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖1 可知，隨著光照強度的增加發(fā)芽糙米滅菌率逐步增高，當光照強度達到0.4 kJ 時，其對應的滅菌率顯著升高（p＜0.05），光照強度達到0.45 kJ 時滅菌率達到最大值90.41%，光照強度進一步增強其滅菌率趨于穩(wěn)定，光照強度為0.50 kJ 與0.55 kJ 時所對應的發(fā)芽糙米滅菌率變化不顯著（p＞0.05）。造成這種現(xiàn)象的原因是脈沖強光作為一種光波物理殺菌技術對于物體的穿透性較差[21]，過低的照射能量不能有效穿透微生物的細胞膜，無法破壞微生物細胞內溶物，因此達不到理想的殺菌效果。經過不同光照強度脈沖強光處理后的糙米發(fā)芽后GABA 富集量呈上升趨勢，其增加幅度呈先增加后小幅度降低的趨勢，光照強度達到0.40 kJ 時，發(fā)芽結束后其GABA 富集量顯著增長（p＜0.05），其原因是照射能量過高對糙米中谷氨酸脫羧酶的活性有一定的抑制作用，導致GABA 富集量減少[22-23]。

2.1.2 照射次數(shù)對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響

照射次數(shù)對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響見圖2。

圖2 脈沖強光照射次數(shù)對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA 富集量的影響Fig.2 The effects of irradiation frequency of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖2 可知，當照射次數(shù)超過300 次時，發(fā)芽糙米滅菌率增加明顯（p＜0.05），當照射次數(shù)為 350、400、450次時，其滅菌率沒有明顯的變化。脈沖強光光照次數(shù)的增加能夠使發(fā)芽GABA 富集量穩(wěn)步增加，當照射次數(shù)超過350 次后，相應的發(fā)芽糙米GABA 富集量增漲顯著（p＜0.05）。以上試驗結果說明當脈沖強光照射達到一定次數(shù)后對糙米的滅菌率提升有限，單純的增加脈沖強光照射次數(shù)并不能增強其滅菌效果，但脈沖強光照射次數(shù)與發(fā)芽糙米GABA 富集量之間存在著一定的正相關。

2.1.3 照射距離對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響

照射距離對發(fā)芽糙米滅菌率及GABA 富集量的影響見圖3。

圖3 脈沖強光照射距離對發(fā)芽糙米滅菌率與GABA 含量的影響Fig.3 The effects of irradiation distance of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖3 可知，隨著照射距離的增加，糙米滅菌率呈先增加再降低的趨勢，當照射距離為9 cm 時其滅菌率最高，達到89.02%，照射距離超過10 cm 后其滅菌率明顯下降（p＜0.05）。在一定的范圍內，照射距離的增加能夠擴大殺菌范圍，從而提高滅菌效果，但是照射距離的增加會造成照射能量的衰減，在超過一定照射距離后，脈沖強光能量衰減到一定程度對微生物細胞壁的穿透效果有限造成了滅菌率的降低。當照射距離超過11 cm 后發(fā)芽后的糙米GABA 富集量明顯降低（p＜0.05），造成這一現(xiàn)象的原因與照射距離增加使脈沖強光能量衰減有關。

2.2 響應面雙響應值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集工藝

2.2.1 響應面試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken 組合設計，以發(fā)芽糙米滅菌率、GABA 富集量為響應值，以脈沖強光的光照強度、照射次數(shù)、照射距離為自變量因素，進行響應面雙響應值聯(lián)合試驗，優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集工藝，應用Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件對影響因素進行編碼組合，具體試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及其試驗結果Table 2 Program and experimental results of response surface analysis

雙響應值（滅菌率、GABA 富集量）所得回歸方程為：

滅菌率R1=91.28-0.11A+0.12B-0.72C+0.93AB-0.13AC+0.24BC-0.64A2-2.08B2-1.46C2；

GABA 富集量 R2=125.85+0.18A-0.18B-0.16C-0.02AB-0.32AC+0.63BC-1.15A2-3.75B2-0.78C2。

兩組回歸方程方差分析見表3 和表4。

表3 發(fā)芽糙米脈沖強光滅菌率回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation for sterilization rate of germinated brown rice

續(xù)表3 發(fā)芽糙米脈沖強光滅菌率回歸方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance for the regression equation for sterilization rate of germinated brown rice

表4 發(fā)芽糙米脈沖強光GABA 富集量回歸方程方差分析表Table 4 Analysis of variance for the regression equation for enrichment of GABA of germinated brown rice

由表3、表4 可知，所設定的各因素對芽糙米脈沖強光滅菌率影響排序為A＞B＞C，即光照強度＞照射次數(shù)＞照射距離，三者對于芽糙米脈沖強光滅菌率影響均為極顯著，交互項AB、AC 對芽糙米脈沖強光滅菌率影響均為極顯著，其他項對芽糙米脈沖強光滅菌率均無顯著影響。所設定的各因素對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響排序為A＞B＞C，即光照強度＞照射次數(shù)＞照射距離，其中光照強度對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響極為顯著，照射次數(shù)對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響顯著，交互項AB 對發(fā)芽糙米GABA 富集量影響顯著，其他項對發(fā)芽糙米GABA 富集量均無顯著影響。發(fā)芽糙米脈沖強光滅菌率回歸模型p 值為0.000 3，發(fā)芽糙米GABA 富集量回歸模型p＜0.000 1，均達到及其顯著水平，失擬項均不顯著，說明了兩組回歸方程擬合度較好，在所選自變量范圍內能夠很好的分析響應值的變化，可以用于發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集工藝的理論值預測。

2.2.2 相關變量間的交互作用

響應面各因素交互作用對發(fā)芽糙米滅菌率的影響見圖4。

圖4 各因素交互作用對發(fā)芽糙米滅菌率的影響Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on sterilization rate

響應面各因素交互作用對發(fā)芽糙米GABA 富集量的影響見圖5。

圖5 各因素交互作用對發(fā)芽糙米GABA 富集量的影響Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on enrichment of GABA of germinated brown rice

由圖4 可知，在本試驗條件下脈沖強光對發(fā)芽糙米的滅菌率為86.74%～92.98%，光照強度、照射次數(shù)、照射距離3 因素交互作用在3D 曲面圖上都存在極值，光照強度、照射次數(shù)二者的交互作用的極值最大，且曲面圖投影的等高線更接近于橢圓形，說明光照強度、照射次數(shù)二者的交互作用對于脈沖強光滅菌率的影響更加顯著，由圖4 中a、c 兩圖可以看出極值點對應的照射距離均為9 cm，因此固定照射距離9 cm 可以縮小極值查找范圍，可選擇光照強度、照射次數(shù)二者的交互作用的等高線來展開接下來的分析。

由圖5 可知，在本試驗條件下發(fā)芽糙米GABA 富集量為123.07 mg/100 g～126.67 mg/100 g，各因素交互作用在3D 曲面圖上都存在最大響應值，說明所選因素取值范圍對應的試驗結果接近極值，通過響應面分析能夠很好的預測試驗結果理論值。3 個3D 曲面圖的側面弧度顯示，光照強度與照射次數(shù)，光照強度與照射距離的弧度較大，且投影等高線均為橢圓形，說明光照強度與照射次數(shù)的交互作用與光照強度與照射距離的交互作用對發(fā)芽糙米GABA 富集量有比較顯著的影響，照射距離與照射次數(shù)交互作用對于發(fā)芽糙米GABA 富集量的影響不明顯。由圖5 中a、c 兩圖可以看出極值點對應的照射距離取值均為9 cm，聯(lián)系上段分析結果可以確定光照強度與照射次數(shù)兩因素對于兩個響應面都有較強的影響，且二者的交互作用對于試驗結果也有較強的顯著性，因此可以將兩因素對發(fā)芽糙米滅菌率、GABA 富集量的交互作用曲面圖進行疊加，分析兩因素對于發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集技術相關度的分析，縮小最優(yōu)區(qū)域取值范圍。

2.2.3 雙響應值聯(lián)合優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集工藝

發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集曲面疊加圖見圖6。

圖6 發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集優(yōu)化曲面疊加圖Fig.6 Superposition graph of contour plots for sterilization coupling GABA enrichment by pulsed light treatment

由圖6 中的曲面可知光照強度、照射次數(shù)與雙響應值呈正相關，相關性系數(shù)為0.813，通過Design-Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件預測雙響應值的最優(yōu)解，最后確定脈沖強光最佳工藝參數(shù)為：光照強度0.448 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.012 cm，在此條件下，發(fā)芽糙米脈沖強光滅菌率預測值為91.28%，GABA 富集量預測值為125.85 mg/100 g，為方便操作對預測最優(yōu)參數(shù)進行修改，選擇光照強度0.45 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.0 cm，作為發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集的最優(yōu)工藝參數(shù)。

2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)驗證試驗

設定脈沖強光參數(shù)光照強度0.45 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.0 cm，進行驗證試驗。結果表明，在此條件下發(fā)芽糙滅菌率為91.15 %，GABA 含量為170.10 mg/100 g，GABA 富集量為 124.03 mg/100 g，分別達到了預測值的99.86%與98.55%，試驗實測值與預測值接近，所得脈沖強光最優(yōu)工藝參數(shù)可靠。

3 結論

以脈沖強光光照強度、照射次數(shù)、照射距離為響應因素，在單因素試驗的基礎上以滅菌率、GABA 富集量為響應值，采用響應面雙響應值聯(lián)合分析法優(yōu)化發(fā)芽糙米脈沖強光殺菌耦合GABA 富集工藝，最后得出脈沖強光處理最優(yōu)工藝為：照強度0.45 kJ，照射次數(shù)395 次，照射距離9.0 cm，在此條件下發(fā)芽糙米滅菌率為91.15%，發(fā)芽糙米γ-氨基丁酸含量為170.10 mg/100 g，γ-氨基丁酸富集量為124.03 mg/100 g。