瞬時受體電位錨蛋白-1對應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠回腸黏膜損傷的影響

徐巖 郄文斌 吳友平 屠偉峰

1第七十四集團(tuán)軍醫(yī)院麻醉科（廣東惠州 516008）；2南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科（廣州 510000）

過度應(yīng)激，如嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷和重大手術(shù)等情況均可引起腸黏膜不同程度的損傷，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)，然而目前尚無有效的防治手段。瞬時受體電位錨蛋白-1（transient receptor potential ankyrin-1，TRPA1）豐富表達(dá)于腸上皮細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞、肥大細(xì)胞和腸肌間神經(jīng)叢以及支配腸的初級傳入神經(jīng)元和其細(xì)胞體所在的相應(yīng)階段的背根神經(jīng)節(jié)。前期研究證明結(jié)腸內(nèi)給予TRPA1的特異性激動劑2，4，6-三硝基苯磺酸或芥子油可引起嚴(yán)重的結(jié)腸炎，這和感覺神經(jīng)元上TRPA1的激活密切相關(guān)［1］。因此本研究在應(yīng)激前給大鼠腹腔注射TRPA1的特異性拮抗劑HC-030031，進(jìn)一步闡明TRPA1在應(yīng)激性腸黏膜損傷中的作用，為臨床有效預(yù)防腸黏膜損傷和促進(jìn)腸道功能恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料雄性Wistar大鼠體質(zhì)量（200±20）g，南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物實驗室提供。實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.2研究方法

1.2.1實驗分組與制備動物模型大鼠24只隨機(jī)分為4組（n=6）：正常對照組（NC組）、WIRS回腸黏膜損傷模型組（WC組）、HCL組和HC2組。后3組放入鼠籠內(nèi)，置（19±1）℃水中，水面平劍突。HC1組和HC2組于浸水束縛應(yīng)激（water immersion restraint stress，WIRS）前1 h腹腔注射HC-030031（Sigma），劑量分別為100和200 mg/kg。WIRS 6 h后麻醉，取背根神經(jīng)節(jié)（DRG）（T10-12）和回腸組織。

1.2.2 RT-PCR檢測DRG中TRPA1的mRNA表達(dá)Trizol提取總RNA后M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。最后SYBR Premix Ex TaqⅡkit進(jìn)行RTPCR。所用引物見表1。

表1 TRPA1和β-ACTIN實時熒光定量PCR引物Tab.1 RT-PCR primers for TRPA1 and β-actin

1.2.3Western Blot檢測回腸組織中TRPA1蛋白表達(dá)100 mg回腸組織加入500 μL RIPA裂解液，勻漿后冰上反應(yīng)30 min，離心后取上清液。根據(jù)BCA法測定蛋白濃度。上樣，再經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（TRPA1濃度1∶1 000）4℃孵育過夜、HRP二抗標(biāo)記，ECL法曝光，Image J軟件進(jìn)行目的條帶灰度值分析。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測DRG和回腸組織中TRPA1的表達(dá)切片脫蠟至水-檸檬酸抗原修復(fù)-3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶-血清封閉、一抗（TRPA1濃度1∶400）4℃孵育過夜-二抗孵育1 h、DAB顯色、蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察切片并拍照、Image-Pro Plus測OD值。

1.2.5回腸組織HE染色切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅染色。顯微鏡下觀察各組切片并拍照、評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照［2］，評分越高，損傷越嚴(yán)重。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗或者one-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1回腸黏膜病理損傷及評分NC組：腸黏膜形態(tài)正常。WC組：腸黏膜表層（約占黏膜全層的1/2）廣泛液化壞死、細(xì)胞剝脫，可見廣泛出血。部分區(qū)域黏膜層完全壞死，殘留黏膜固有層間質(zhì)毛細(xì)血管充血明顯；部分區(qū)域黏膜表層剝脫，表層上皮細(xì)胞與固有層明顯分離。局部黏膜層中淋巴濾泡高度反應(yīng)性增生，生發(fā)中心明顯。與NC組比較，WC組腸黏膜損傷嚴(yán)重，評分明顯增高（P＜0.001）；與WC組比較，HC1組和HC2組腸黏膜損傷情況明顯好轉(zhuǎn)，評分明顯降低（P＜0.01）；且HC2組比HC1組損傷評分更低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 HC-030031減輕WIRS誘導(dǎo)的回腸黏膜損傷病理學(xué)圖像Fig.1 Pathological images of HC-030031 alleviated WIRS-induced IML

2.2 DRG中TRPA1的mRNA表達(dá)與NC組相比，WC組DRG中TRPA1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖2。

2.3DRG中TRPA1蛋白表達(dá)與NC組相比，WC組DRG中TRPA1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖3。

圖2 WIRS誘導(dǎo)DRG中TRPA1的mRNA表達(dá)上調(diào)Fig.2 WIRS up-regulation TRPA1 mRNA expression in DRG

圖3 WIRS誘導(dǎo)DRG中TRPA1蛋白表達(dá)上調(diào)Fig.3 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in DRG

2.4回腸中TRPA1的蛋白表達(dá)與NC組比較，WC組回腸中TRPA1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖4。

2.5回腸組織中TRPA1蛋白表達(dá)與NC組相比，WC組回腸組織中TRPA1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖5。

3 討論

圖4 WIRS誘導(dǎo)回腸組織中TRPA1蛋白表達(dá)上調(diào)（WB）Fig.4 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in ileal（WB）

圖5 WIRS誘導(dǎo)回腸組織中TRPA1蛋白表達(dá)上調(diào)（免疫組化）Fig.5 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in ileal（IHC）

TRPA1是與溫度、機(jī)械或化學(xué)刺激有關(guān)的非選擇性陽離子鈣通道，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+是通道門控的重要調(diào)節(jié)因子。大量研究［3］表明TRPA1在急慢性疼痛、咳嗽和多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但是，TRPA1在應(yīng)激性回腸黏膜損傷中的作用國內(nèi)外尚未見報道，因此本文對此進(jìn)行研究。筆者的免疫組織化學(xué)結(jié)果證實TRPA1在回腸和支配回腸相應(yīng)階段的DRG（T10-12）有豐富表達(dá)。NOZAWA等［4］也報道，通過RT-PCR檢測，與其他器官相比，TRPA1在大鼠的小腸中mRNA表達(dá)水平最高，這些都決定了TRPA1在調(diào)控小腸的運(yùn)動、分泌和血流中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)浸水束縛應(yīng)激能誘導(dǎo)回腸和支配回腸組織相應(yīng)階段DRG中TRPA1表達(dá)上調(diào)（圖2～5），回腸黏膜損傷。這可能是因為TRPA1被激活時可促使Ca2+通過TRPA1內(nèi)流，引起下游通路P物質(zhì)釋放，而P物質(zhì)具有激活肥大細(xì)胞的生物學(xué)活性［5］。肥大細(xì)胞廣泛分布于內(nèi)臟黏膜下的微血管周圍，被激活時可釋放組胺、5-HT、P物質(zhì)、血小板活化因子、白三烯等物質(zhì)；同時，TRPA1被激活時，可以改變上皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)腸嗜鉻細(xì)胞釋放大量5-HT，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞超極化，引起濃度依賴式的張力性血管舒張［6］，這些均可引起血管通透性增強(qiáng)及血管蛋白滲漏和中性粒細(xì)胞浸潤并參與炎癥反應(yīng)［7-8］，導(dǎo)致回腸水腫、糜爛、潰瘍甚至出血。同時，P物質(zhì)也能改變免疫功能，促進(jìn)炎癥因子的釋放，引起腸黏膜損傷［9］。同時，筆者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)TRPA1在支配胃腸道的背根神經(jīng)節(jié)和感覺神經(jīng)纖維中有功能表達(dá)［10-11］，所以，TRPA1能夠調(diào)節(jié)胃腸道炎癥和外源性傳入和傳出感覺神經(jīng)纖維的作用［12］。TRPA1表達(dá)在腸上皮細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞、肥大細(xì)胞和一系列傷害性感覺神經(jīng)元，其中很多細(xì)胞具有感覺特性，能與臨近的傷害性感受器（nociceptor）進(jìn)行交流，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)在腸損傷中發(fā)揮重要作［13-14］。MEENTS等［13］報道TRPA1在傷害性感覺神經(jīng)元中表達(dá)，可被內(nèi)源性炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激代謝物激活。這些因素共同作用引起腸黏膜損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)浸水束縛應(yīng)激前給大鼠腹腔注射TRPA1特異性拮抗劑HC-030031，抑制TRPA1的表達(dá)，從而抑制了后續(xù)發(fā)生的一系列傷害性反應(yīng)，可以明顯改善應(yīng)激性腸黏膜的損傷情況。NAKAMURA等［15］研究證明，預(yù)先給于HC-030031可以明顯改善小鼠足底注射TRPA1的激動劑異硫氰酸烯丙酯引起的P物質(zhì)釋放、傷害性行為、熱痛覺過敏、水腫和炎癥反應(yīng)，這和筆者的研究結(jié)論相似。

總之，應(yīng)激引起的急性腸黏膜損傷被認(rèn)為是機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、局部腸黏膜缺血缺氧、腸黏膜嚴(yán)重的微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤及各種促炎癥因子的產(chǎn)生等多因素共同作用，最終導(dǎo)致腸黏膜損傷因素增強(qiáng)、保護(hù)屏障破壞，維持腸黏膜完整性的平衡因子失調(diào)的后果。但是TRPA1具體通過哪些通路影響胃腸道功能，需要筆者進(jìn)一步研究和探索。