體外沖擊波結(jié)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔骨不連的療效

樊濤 郭榮 鄭彭

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（廣州 510282）

骨不連是臨床上的常見難題，保守治療效果差，目前治療骨不連的主要手段是自體骨移植手術(shù)，但手術(shù)創(chuàng)傷較大，風(fēng)險較高，容易發(fā)生取骨區(qū)感染、感覺障礙、血腫等并發(fā)癥［1］，尋求一種安全有效的治療方法已成為研究的方向和熱點(diǎn)。大量研究表明體外沖擊波（extracorporeal shock waves，ESW）促進(jìn)骨折愈合療效確切，但目前還不清楚ESW促進(jìn)骨折愈合的確切機(jī)制［2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可在特定誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞等，促進(jìn)骨折愈合［3］；但BMSCs在骨髓中只占0.001% ～0.01%，含量極少，因此，提高BMSCs的含量在治療骨不連中非常重要。BMSCs在增殖與分化過程中需要力學(xué)因素的刺激，沖擊波是一種力學(xué)機(jī)械刺激，可促進(jìn)局部 BMSCs的增殖［4］。BMSCs移植治療骨不連取得了一定的治療效果，但是將ESW結(jié)合BMSCs移植治療骨不連卻鮮有報道，本課題通過動物實(shí)驗(yàn)，觀察ESW結(jié)合BMSCs治療兔骨不連的療效，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物的分組選用健康成年中國家兔54只，體質(zhì)量2.5～3.1 kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表方法分3組。A組：ESW（翔宇醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司，XY-K-SHOCKMASTER 500標(biāo)準(zhǔn)款）結(jié)合BMSCs組；B組：ESW組；C組：完全對照組。

1.2骨不連模型的制作實(shí)驗(yàn)動物采用速眠新與氯氨酮1∶1比例0.25 mL/kg肌注麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，在右前臂橈側(cè)沿橈骨作一長2 cm切口，顯露橈骨，在距橈骨遠(yuǎn)端2 cm處截骨，制作1 cm骨缺損（包括骨膜）。術(shù)后12周拍X線片明確為橈骨骨不連（骨缺損間距未見縮小，未見到骨痂形成，明確為橈骨骨不連）。

1.3兔BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定［5］取A組的兔子，抽取股骨中下1/3肝素化骨髓血3 mL，通過Percoll分離液梯度離心，獲取兔BMSCs，加入DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后進(jìn)行第1次換液，以后每3天換1次液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，2周后基本長滿培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞生長至90%融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。計(jì)P3、P4代BMSCs細(xì)胞數(shù)，達(dá)到1×106/mL即可用于移植。

1.4兔骨不連治療實(shí)驗(yàn)對A組兔子進(jìn)行無菌麻醉，在透視下，用l mL的注射器取調(diào)整好的0.5 mL自體BMSCs細(xì)胞懸液注射到骨不連斷端處約4 mm深。A組兔子在自體BMSCs移植治療后2～3 d，無不良反應(yīng)，進(jìn)行ESW治療；B組兔子骨不連斷端采用ESW治療。沖擊波參數(shù)：電壓：8.5 kV，頻率：60次/min，能流密度為0.30 mJ/mm2，分別對準(zhǔn)骨不連近、遠(yuǎn)端邊緣相對應(yīng)部位，每端擊打1 000次，每隔3～5 d治療1次，共治療3次。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1一般觀察結(jié)果觀察術(shù)后及治療后兔的進(jìn)食、活動及精神狀況。

1.5.2X線拍片觀察骨不連模型12周后行X線拍片（X線攝片機(jī)，型號BFG-400，南京醫(yī)療設(shè)備制造廠），并分別于治療后4、8、12周重復(fù)拍片，均拍麻醉后側(cè)臥位片，由同一位醫(yī)生使用同一臺X線機(jī)拍片。X線評分標(biāo)準(zhǔn)參考Lane-Sandhu法［6］，評價指標(biāo)為骨形成情況、骨連接情況及骨髓腔改建程度，判斷骨不連愈合情況。見表1。

1.5.3組織學(xué)檢查分別在骨不連治療后4、8、12周拍片后各組隨機(jī)處死6只兔子，均取原骨不連部位修復(fù)組織進(jìn)行脫鈣、固定、石蠟包埋、切片，H-E染色后光鏡檢查組織情況。根據(jù)KHADRA等［7］和PRETEL等［8］的研究，制定組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Lane-Sandhu法X線評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Lane-Sandhu method X-ray scoring standard

表2 骨組織的形成和質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Bone tissue formation and quality assessment criteria

2 結(jié)果

2.1一般觀察結(jié)果A組兔子自體BMSCs移植后，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。2只兔子麻醉意外死亡，重新納入2只兔子，總數(shù)不變。在ESW治療后24 h，A、B組兔骨不連處均可見不同程度的皮下瘀血，但未明顯影響兔子飲食和活動。

2.2X線檢查及放射學(xué)評分

2.2.1X線檢查治療后4周時，A、B組骨不連處略見模糊骨痂形成，影像呈薄云霧狀；C組未見骨痂形成。治療后8周時，A組骨痂逐漸增多，骨髓腔基本通暢，但骨紋理較亂；B組骨不連區(qū)兩端可見明顯新生骨痂；C組未見明顯變化。治療后12周時，A組整個骨不連區(qū)均可見新生骨痂，形成骨不連區(qū)的橋接，骨不連區(qū)骨髓腔形成再通后腔內(nèi)皮質(zhì)骨形成；B組整個骨不連區(qū)均可見新生骨痂，骨髓腔未形成；C組未見明顯新生骨痂形成。

2.2.2放射學(xué)評分見表3。治療后4周時，A組和B組評分均增加，C組評分未見明顯增加，A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后8周時，A組評分較B、C組均明顯增加，A組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組評分增加，C組評分未見明顯增加，B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后12周時，A組評分較B、C組均明顯增加，A組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組評分明顯增加，C組評分稍有增加，B、C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

表3 各組治療后4、8、12周Lane-Sandhu法X線評分比較Tab.3 Comparison of Lane-Sandhu X-ray scores at 4，8，and 12 weeks after treatment in each group（n=18） ±s

表3 各組治療后4、8、12周Lane-Sandhu法X線評分比較Tab.3 Comparison of Lane-Sandhu X-ray scores at 4，8，and 12 weeks after treatment in each group（n=18） ±s

注：①A組與B組比較，P＞0.05；A、B組分別與C組比較，P＜0.05；②A組分別與B、C組比較，P＜0.05；B組與C組比較，P＜0.05；③A組分別與B、C組比較，P＜0.05；B組與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組治療后4周2.28±0.48①2.13±0.58①0.10±0.32①治療后8周5.39±0.48②3.14±0.68②0.20±0.42②治療后12周8.60±0.52③4.35±0.72③0.30±0.48③

2.3組織學(xué)觀察及評分結(jié)果

2.3.1組織學(xué)觀察A組：治療后4周時骨不連區(qū)周圍有少量的纖維組織包繞，中等軟骨痂量，少量炎癥細(xì)胞侵入；治療后8周時骨不連區(qū)骨痂量明顯增加，可見散在骨小梁形成；治療后12周時骨不連區(qū)大量成熟骨痂形成，可見骨小梁形成。B組：治療后4周時空腔內(nèi)血管纖維組織長入，可見少量成骨細(xì)胞；治療后8周時骨不連區(qū)有軟骨痂形成；治療后12周時骨不連區(qū)少量成熟骨痂形成，骨小梁結(jié)構(gòu)不明顯。C組：纖維組織長滿骨不連區(qū)，未見明顯骨痂形成。

2.3.2組織學(xué)評分治療后4周時，A組評分增加，B、C組評分未見明顯增加，A組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后8周時，A組評分明顯增加，B組評分增加，C組評分稍增加，A組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后12周時，A組評分明顯增加，B組評分增加，C組評分稍增加，A組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

ESW利用液電轉(zhuǎn)化及傳遞原理，造成不同密度組織之間產(chǎn)生能量梯度差及扭拉力，以達(dá)到治療疾病的目的［9］。ESW在以往常被用來治療骨科疾病，如肌腱末端病，慢性足底筋膜炎、肱骨外上髁炎和骨不連等［10-12］。ALVAREZ 等［13］運(yùn)用 ESW治療跖骨近端骨不愈合或骨不連時，1年后達(dá)到90%的成功治愈率。ESW治療骨不連的作用機(jī)制，目前尚未完全清楚。實(shí)驗(yàn)研究表明，ESW對骨組織直接作用后可以造成骨膜下點(diǎn)狀出血，產(chǎn)生微骨折和大量細(xì)小的骨碎片，造成局部微損傷，并可能有骨折血腫形成，從而刺激骨痂形成，促進(jìn)骨折愈合［14］。國內(nèi)外大量動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)ESW作用于骨組織后，能夠改善局部微循環(huán)，激活處于靜止?fàn)顟B(tài)的對骨折愈合具有重要意義的成骨細(xì)胞和原始成纖維細(xì)胞等細(xì)胞，增強(qiáng)其成骨活性，促使骨形態(tài)生成蛋白（BMP）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等誘導(dǎo)成骨的介質(zhì)釋放增加［15］。BMP、TGF-β等具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞遷徙、增殖、分化，最終導(dǎo)致軟骨、骨形成的作用［16］，可重新啟動骨折愈合過程。

表4 各組治療后4、8、12周修復(fù)區(qū)組織學(xué)評分比較Tab.4 Comparison of histological scores in repaired areas at 4，8，and 12 weeks after treatment（n=18） ±s

表4 各組治療后4、8、12周修復(fù)區(qū)組織學(xué)評分比較Tab.4 Comparison of histological scores in repaired areas at 4，8，and 12 weeks after treatment（n=18） ±s

注：①A組分別與B、C組比較，P＜0.05；B組與C組比較，P＞0.05；②A組分別與B、C組比較，P＜0.05；B組與C組比較，P＜0.05；③A組分別與B、C組比較，P＜0.05；B組與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組治療后4周1.80±0.42①1.20±0.42①1.10±0.32①治療后8周2.60±0.52②1.80±0.62②1.20±0.42②治療后12周3.50± 0.53③1.90± 0.74③1.30± 0.48③

骨不連為骨折愈合修復(fù)過程停止。依據(jù)組織微損傷理論，在骨不連組織的局部創(chuàng)造一個新的微損傷環(huán)境，可重新啟動骨折修復(fù)，其釋放的生物活性因子不但會激活組織自身的修復(fù)能力，還能促進(jìn)移植或者遷移到局部的BMSCs在損傷局部微環(huán)境刺激下趨化、生長，啟動BMSCs的定向分化，從而促進(jìn)組織的再生與修復(fù)［17］。

研究表明，骨折的修復(fù)過程存在軟骨成骨和膜內(nèi)成骨兩種骨化形式，無論哪種形式，都需要骨折部位聚集足夠數(shù)量的BMSCs，再由BMSCs分化成軟骨或成骨細(xì)胞。因此BMSCs就成為治療骨不連的理想種子細(xì)胞，向骨不連部位引入足夠的干細(xì)胞是促進(jìn)骨修復(fù)的前提條件［18］，但BMSCs在骨髓中只占0.001%～0.01%，筆者利用這一原理，將BMSCs移植和ESW治療相結(jié)合進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。筆者參考Lane-Sandhu法，以骨形成情況、骨連接情況、骨髓腔改建程度為評價指標(biāo)，進(jìn)行放射學(xué)評分，判斷骨不連愈合情況，其信度及效度已得到檢驗(yàn)，能夠客觀反映骨不連的愈合情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ESW結(jié)合BMSCs移植治療骨不連和單純的ESW治療均有效，ESW結(jié)合BMSCs移植治療骨不連較單純的ESW治療效果更好。BMSCs具有自我更新及多向分化的能力，能通過增殖與分化維持自身細(xì)胞的數(shù)量，并可在適當(dāng)?shù)臈l件下分化成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等［9］，滿足骨不連區(qū)域的修復(fù)需要。BMSCs不僅可直接遷移、分化為成骨細(xì)胞，還可以通過分泌各種生物活性分子及細(xì)胞外膜泡等調(diào)節(jié)損傷區(qū)域的血管形成、抑制成骨纖維化、抗細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)成骨分化等［19］，這些作用對骨不連治療均有重要意義。BMSCs在增殖與分化過程中需要力學(xué)因素的刺激，沖擊波是一種力學(xué)機(jī)械刺激，通過力-化學(xué)信號轉(zhuǎn)換將這種刺激轉(zhuǎn)化成生物應(yīng)答，促進(jìn)局部BMSCs的增殖，提高BMSCs的數(shù)量，以滿足組織修復(fù)或重建，從而加速骨缺損修復(fù)［4］。ESW干預(yù)BMSCs成骨作用存在劑量效應(yīng)依賴關(guān)系。MARTINI等［20］研究不同劑量ESW對羊初級母細(xì)胞的作用效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能量＜0.31 mJ/mm2時對骨細(xì)胞的生長有明顯的促進(jìn)作用，大于此值時可引起骨細(xì)胞的損傷，故本實(shí)驗(yàn)使用的ESW能量為0.30 mJ/mm2。

綜上所述，ESW結(jié)合BMSCs移植治療兔骨不連和單純的ESW治療均有效，ESW結(jié)合BMSCs移植治療兔骨不連較單純的ESW治療效果更好。關(guān)于ESW促進(jìn)BMSCs的增殖及分化為成骨細(xì)胞的機(jī)制已有一些研究，但仍未完全清楚。因此，研究ESW如何促進(jìn)BMSCs的增殖及分化為成骨細(xì)胞的機(jī)制將是下一步研究的方向。