二甲雙胍減緩2型糖尿病小鼠非酒精性脂肪肝的作用

王一春 沈揚(yáng) 劉萍

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科（銀川750004）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代謝紊亂為主要臨床表現(xiàn)的一種慢性代謝疾病［1］。近年來糖尿病的患病率和病死率逐年上升，對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病與非酒精性脂肪肝（non alcohol fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生密切相關(guān)［2］，糖尿病患者NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是一般人群的3倍［3］，目前除生活干預(yù)外，并未發(fā)現(xiàn)有效治療NAFLD的方法［4］，NAFLD作為糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，已逐漸受到人們的關(guān)注。

二甲雙胍由于其降糖效果好、無肝腎毒性、心血管保護(hù)作用等優(yōu)點(diǎn)，已成為公認(rèn)的臨床一線降糖藥［5］。已有研究證實(shí)，二甲雙胍對(duì)NAFLD有一定的治療作用［6］，但其延緩NAFLD進(jìn)展的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究二甲雙胍對(duì)T2DM小鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展的影響并探討其作用機(jī)制，為二甲雙胍臨床應(yīng)用的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑鹽酸二甲雙胍（A14202005856）購自北京京豐制藥集團(tuán)有限公司；AMPKα1（BS1010）、p-AMPKα1（BS4010）抗體均購自美國 Bioworld公司；ACC（bs-11912R）、p-ACC（bs-3039R）、HIF-1α（bs-0737R）、GAPDH（bs-2188R）抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。AST（C0010-2）、ALT（C009-2）試劑盒均購自南京建成生物工程所有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組自發(fā)肥胖T2DM db/db小鼠和正常db/m小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，雄性，體質(zhì)量18～21 g，4～6周齡，SPF級(jí)。飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。db/db小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，剪尾取血法測(cè)定血糖，篩選出糖尿病小鼠20只，隨機(jī)分成2組，即糖尿病模型組和二甲雙胍組，每組10只；以10只同周齡的雄性正常db/m小鼠為正常對(duì)照組。糖尿病模型組和正常對(duì)照組灌胃蒸餾水，二甲雙胍組灌胃二甲雙胍（0.16 g/kg），各組均每天灌胃1次，連續(xù)給藥8周，8周后處死取出肝臟組織［7］。1.3HE染色取相同部位肝臟組織，中性福爾馬林固定液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水浸洗。常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，200倍光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4外周血天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測(cè)末次給藥后，吸入麻醉小鼠，迅速摘取眼球取血于1.5 mL EP管中，分離血清。微板法測(cè)定各組小鼠血清中AST和ALT的水平。

1.5免疫組化檢測(cè)石蠟包埋的肝臟組織經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水浸洗，抗原修復(fù)后，一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，二抗37℃孵育1 h，PBS沖洗3次，DAB顯色，復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片，400倍光鏡下觀察蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)測(cè)量各組蛋白的平均光密度。

1.6Western Blot檢測(cè)提取100 mg小鼠肝臟組織，加入蛋白裂解液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。定量上樣蛋白（按照60 μg），加5×上樣緩沖液，蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗4℃孵育過夜，次日復(fù)溫1 h，二抗37℃孵育1 h，TBST漂洗3次，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影。采用Image J圖像處理系統(tǒng)測(cè)量各樣本條帶灰度值。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多組樣本均數(shù)間的比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肝臟組織形態(tài)的比較HE染色顯示，正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞索排列整齊，無炎性細(xì)胞和脂滴浸潤。糖尿病模型組出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變，肝細(xì)胞索排列紊亂，體積增大，呈空泡狀，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量脂滴。二甲雙胍組肝小葉結(jié)構(gòu)較清楚，胞質(zhì)內(nèi)脂滴較糖尿病模型組明顯減少。見圖1。

2.2各組小鼠血清中AST、ALT表達(dá)情況二甲雙胍組AST、ALT水平較糖尿病模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.994，56.892，均P＜0.01）。見表1。

2.3免疫組化法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中蛋白表達(dá)情況

2.3.1各組小鼠肝臟組織中AMPKα1蛋白表達(dá)情況正常對(duì)照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組小鼠肝臟組織中AMPKα1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.135 ± 0.043）、（0.124 ± 0.015）、（0.153 ± 0.126），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.106；P＜0.01），二甲雙胍組AMPKα1蛋白表達(dá)量明顯高于其他組。見圖2。

圖1 小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×200）Fig.1 Histological observation of liver in mice（HE Staining，× 200）

表1 各組小鼠血清中AST、ALT表達(dá)水平Tab.1 Expression of AST，ALT in serum of mice in each group ±s，U/L

表1 各組小鼠血清中AST、ALT表達(dá)水平Tab.1 Expression of AST，ALT in serum of mice in each group ±s，U/L

注：與正常對(duì)照組相比較，*P＜0.05；與糖尿病模型組相比較，#P＜0.05

分組正常對(duì)照組糖尿病模型組二甲雙胍組AST 4.738±0.751 8.486±0.922*5.548±0.329#ALT 3.502±1.266 15.690±1.223*9.091±1.671*#

2.3.2各組小鼠肝臟組織中ACC蛋白表達(dá)情況正常對(duì)照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組小鼠肝臟組織中ACC蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.190±0.084）、（0.232±0.599）、（0.143±0.385），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=144.146，P＜0.01），糖尿病模型組ACC蛋白表達(dá)量明顯高于其他處理組。見圖3。

2.3.3各組小鼠肝臟組織中p-ACC蛋白表達(dá)情況正常對(duì)照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組小鼠肝臟組織中p-ACC蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.213± 0.110）、（0.140 ± 0.254）、（0.280 ± 0.325），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.317，P＜0.01），二甲雙胍組p-ACC蛋白表達(dá)量明顯高于其他組。見圖4。

圖2 免疫組化法檢測(cè)各組肝臟組織中AMPKα1蛋白表達(dá)情況（×400）Fig.2 Detection of AMPK α 1 protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

圖3 免疫組化法檢測(cè)各組肝臟組織中ACC蛋白表達(dá)情況（×400）Fig.3 Detection of ACC protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

圖4 免疫組化法檢測(cè)各組肝臟組織中p-ACC蛋白表達(dá)情況（×400）Fig.4 Detection of p-ACC protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

2.3.4各組小鼠肝臟組織中HIF-1α蛋白表達(dá)情況正常對(duì)照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組小鼠肝臟組織中HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.168± 0.269）、（0.207 ± 0.234）、（0.149 ± 0.255），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=423.386，P＜0.01），糖尿病模型組HIF-1α蛋白表達(dá)量明顯高于其他組（P＜0.01）。見圖5。

2.4Western Blot法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中蛋白表達(dá)情況以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J圖像處理系統(tǒng)測(cè)量各組AMPKα1和HIF-1α蛋白表達(dá)水平，并計(jì)算與內(nèi)參條帶灰度值的比值（圖6A），結(jié)果顯示，二甲雙胍組AMPKα1蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平明顯高于正常對(duì)照組和糖尿病模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.197，483.402；均P＜0.01）。糖尿病模型組ACC蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組和二甲雙胍組，而二甲雙胍組ACC磷酸化水平高于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=383.751，390.177；均P＜ 0.01）。糖尿病模型組HIF-1α蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組和二甲雙胍組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=634.345，P＜0.01）。見圖6。

3 討論

近年來，T2DM引起的各種并發(fā)癥是糖尿病患者致死致殘的主要原因，非酒精性脂肪肝在人群中的患病率逐年升高，已成為引起我國慢性肝病發(fā)生的主要病因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM所致的代謝紊亂是NAFLD發(fā)病的高危因素，T2DM與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)［8］。二甲雙胍作為一線降糖藥在臨床上廣泛使用，不僅降糖效果好，在抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生方面也有巨大作用［9-10］。目前二甲雙胍在糖尿病患者肝損傷中的保護(hù)作用已受到人們廣泛關(guān)注，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。

圖5 免疫組化法檢測(cè)各組肝臟組織中HIF-1α蛋白表達(dá)情況（×400）Fig.5 Detection of HIF-1α protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

圖6 Western Blot法檢測(cè)各組肝臟組織中AMPKα1、p-AMPKα1、ACC、p-ACC和HIF-1α蛋白表達(dá)情況Fig.6 Detection of AMPKα1，p-AMPKα1，ACC，p-ACC and HIF-1α protein expression in liver tissues of all groups by Western Blot

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組小鼠肝臟組織中出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變，二甲雙胍干預(yù)后肝細(xì)胞脂肪變性情況明顯減輕，胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少，提示T2DM可能與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)，二甲雙胍可能通過改善糖尿病小鼠脂代謝紊亂，減少肝臟組織脂肪含量，進(jìn)而減緩NAFLD的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以下調(diào)糖尿病小鼠肝組織中的脂質(zhì)水平，防止糖尿病引起的代謝紊亂，減輕肝臟脂肪變性和病理損傷［11］。此外，本研究糖尿病模型組AST、ALT明顯高于其他組，二甲雙胍干預(yù)后AST、ALT水平明顯降低，血清AST水平反映肝細(xì)胞功能、ALT水平反映肝臟脂肪沉積的狀況，表明二甲雙胍可能改善糖尿病小鼠的肝功能，減少肝細(xì)胞脂肪沉積，這與ROZANA等［12］的研究結(jié)果一致。但是，本研究并沒有探討二甲雙胍對(duì)肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響，后續(xù)將進(jìn)一步開展。

目前二甲雙胍在糖尿病患者肝損傷保護(hù)作用中的機(jī)制尚不完全清楚，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組AMPKα1、p-AMPKα1、p-ACC蛋白表達(dá)水平明顯高于其他組，而ACC蛋白表達(dá)水平明顯低于其他組，提示二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路，促進(jìn)ACC蛋白磷酸化，改善糖尿病小鼠脂代謝紊亂，減緩NAFLD的發(fā)生。有研究報(bào)道，二甲雙胍作為AMPK激活劑，通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路，促進(jìn)ACC蛋白磷酸化，使ACC蛋白失活，抑制肝糖異生和膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成，加速脂肪酸氧化，減少脂肪酸的堆積，進(jìn)而減緩NAFLD的發(fā)生［13］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯低于其他組，表明二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路抑制HIF-1α蛋白表達(dá)，降低游離脂肪酸的合成速度，減少脂質(zhì)在肝臟中的沉積。糖尿病患者由于氧需增加、供氧不足處于缺氧狀態(tài)，而缺氧可以誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)游離脂肪酸的合成，減少肝臟脂肪代謝，增加脂質(zhì)在肝臟中的沉積，進(jìn)而促進(jìn)NAFLD的發(fā)生［14-15］，當(dāng)AMPK激活時(shí)可能通過抑制mTOR復(fù)合物的功能進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白合成的作用［16］。

綜上所述，T2DM與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，二甲雙胍可能通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路、促進(jìn)ACC蛋白磷酸化，抑制HIF-1α表達(dá)，降低游離脂肪酸合成速度，加速脂肪酸氧化，減少脂肪酸堆積，進(jìn)而起到減緩NAFLD發(fā)生的作用。