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    基于宏基因策略的新穎木聚糖酶基因cbxynA克隆及其重組酶酶學(xué)性質(zhì)

    2019-10-12 06:01:26崔曉亭王小藝趙峙堯柳佳蕓裴鵬剛熊蘇玥
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:文庫(kù)聚糖底物

    熊 科 崔曉亭 王小藝 趙峙堯 柳佳蕓 裴鵬剛 鄧 蕾 熊蘇玥

    (1北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048

    2北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048

    3北京工商大學(xué) 北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048

    4北京工商大學(xué) 北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048)

    我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),伴隨著農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)加工,每年產(chǎn)生大量農(nóng)業(yè)廢棄物。這些農(nóng)業(yè)廢棄物資源再生利用率極低,大部分被浪費(fèi)[1-2]。大力開發(fā)利用這些資源可以緩解環(huán)境、資源和糧食危機(jī),因此農(nóng)業(yè)廢棄物再利用成為近十幾年各國(guó)研究的熱點(diǎn)[3]。木聚糖是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的半纖維素,為世界第二大可再生資源[4]。由于木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,它的徹底水解需要一系列酶的協(xié)同作用,其中最關(guān)鍵的酶是木聚糖酶[5]。在眾多應(yīng)用中,以木聚糖經(jīng)酶法制取有較高附加值的功能低聚糖,是富含半纖維素材料的農(nóng)業(yè)廢棄物再生利用的有效增值途徑,具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義[6-8]。而木聚糖酶屬水解酶類,在碳循環(huán)過程中發(fā)揮了不可替代的功能,具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值,目前已成功應(yīng)用于食品、飼料、釀造、造紙、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域[9-11]。

    目前,多數(shù)木聚糖酶來(lái)源于各類天然微生物菌株,通過天然產(chǎn)酶方式獲得的木聚糖酶多為復(fù)合酶,表達(dá)量低,且不易純化[12]。由于自然界中99%以上的微生物是不能被純培養(yǎng)利用,因此該方法得到的產(chǎn)木聚糖酶菌株十分有限,僅局限于不到1%的微生物基因資源,對(duì)自然界中所占比例較大的非培養(yǎng)微生物資源無(wú)法利用[13]。近年來(lái),越來(lái)越多的學(xué)者基于宏基因組的方法篩選木聚糖酶。如汪國(guó)增等[14]通過構(gòu)建瘤胃宏基因組文庫(kù),從中篩選到酶學(xué)性質(zhì)較為新穎的木聚糖酶,其最適作用溫度30℃,可用于果汁的澄清,生產(chǎn)飼料等工業(yè)。張鵬等[15]從堆肥構(gòu)建的宏基因組文庫(kù)中篩選到性質(zhì)較為優(yōu)良的纖維素酶和木聚糖酶,可用于造紙等工業(yè)。Bao等[16]從牦牛瘤胃等宏基因文庫(kù)中篩選到能提高木聚糖酶活力的纖維素酶,可用于食品加工,動(dòng)物飼料的加工。Hu Y等[17]從土壤宏基因文庫(kù)中篩選到一種低溫耐堿酶,與常規(guī)木聚糖酶不同,可用于制備生物燃料、燃料乙醇。GonX等[18]從牛瘤胃等中篩選到無(wú)纖維素酶活力的木聚糖酶,可用于紙漿漂白等工業(yè)化應(yīng)用。Mo XC等[19]從土壤宏基因組文庫(kù)中篩選到一種多功能酶,能夠制備低聚木糖。從來(lái)源上比較,木聚糖酶廣泛來(lái)源于各種環(huán)境,如海洋、陸地等。而土壤微生物是木聚糖酶的巨大來(lái)源庫(kù),通常每1 g土壤中有幾億到幾百億個(gè)微生物,雖然土壤宏基因文庫(kù)構(gòu)建面臨的干擾因素多、難點(diǎn)大,如腐殖酸的去除等,但構(gòu)建土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫(kù)能更廣泛地獲得木聚糖酶優(yōu)良基因資源。本研究以土壤環(huán)境作為宏基因來(lái)源對(duì)酶進(jìn)行發(fā)掘,相比其它環(huán)境的宏基因來(lái)源可大大提高尋找和發(fā)現(xiàn)新木聚糖酶基因的概率,理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值較大。利用HiTAIL-PCR將獲得非培養(yǎng)的木聚糖酶基因全長(zhǎng)進(jìn)行異源表達(dá),為更好地開發(fā)利用土壤未培養(yǎng)微生物資源,發(fā)掘新穎的木聚糖酶資源奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    土壤樣品來(lái)自云南、貴州、河南、河北等15個(gè)地區(qū)。樣品采用鐵鏟采集,用刮刀除去5 cm厚的表層土。將采集的土壤樣品保存于無(wú)菌塑料袋中,于-4℃冰箱保存待用。

    1.2 主要試劑

    DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(美國(guó)OMEGA);瓊脂糖(西班牙 Biowest);十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司;RNA酶,蛋白酶K來(lái)自(日本 TAKARA);Sau 3A I、BamH I、CIAP、T4 DNA 連 接 酶 、Q5 DNA 聚 合 酶 、λDNA/Hind III、DL2000、1 kb PlusDNA Ladder,pUC19、E.coli DH5、pET28a 載體、E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(日本TAKARA);氨芐霉素(Amp)蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)(英國(guó) Oxford公司);Gel Exraction Kit(美國(guó) OMEGA);剛果紅,卡那霉素(美國(guó) AMRESCO);櫸木木聚糖(美國(guó) Sigma)。

    1.3 主要設(shè)備與儀器

    DYC P-31BN水平電泳槽、DYY-10C電泳儀,北京六一儀器廠;Image Quant 300凝膠成像儀、Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器,美國(guó) GE公司;Sigma 1-14小型臺(tái)式高速離心機(jī),美國(guó) Sigma公司;WD-9405B型水平搖床,北京六一;PCR儀,Biometra,德國(guó);ImageQuant 300 凝膠成像儀,Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器,美國(guó)GE;瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一;DHZ-DA全溫振蕩器,江蘇太倉(cāng)培英;WD-9405B型水平搖床,北京六一;Nanodrop核酸定量?jī)x,Thermo公司。

    1.4 土壤宏基因組文庫(kù)構(gòu)建

    每次稱取80 g土壤,用提取緩沖液(Tris-HCl:100 mmol/L pH 8.0;EDTA:100 mmol/L,pH 8.0;NaCl:1.5 mol/L;CTAB:1%)溶解稀釋土樣,225 r/min?;靹?~3 h。具體提取方法參照Z(yǔ)hou等[20]。將回收后的DNA片段采用Sau3A I進(jìn)行部分酶切,并與經(jīng)BamH I酶切后與pUC19載體進(jìn)行連接,電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到DH5α中。

    1.5 土壤宏基因組文庫(kù)的篩選

    土壤宏基因組文庫(kù)的篩選方法參照Kwon等[21],將文庫(kù)中的克隆子轉(zhuǎn)接到含有0.5%的木聚糖底物的平板上培養(yǎng)24 h,將平板放置在50℃烘箱30 min后,剛果紅染色15 min,1 mol/L的Na-Cl脫色15 min,在底物平板上能產(chǎn)生透明圈的克隆即為陽(yáng)性克隆。

    1.6 木聚糖酶基因cbxynA序列分析

    對(duì)上述篩選得到的陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒并測(cè)序,用在線軟件預(yù)測(cè)外源插入片段所有可能的開放閱讀框,用DNAMAN預(yù)測(cè)目的基因可能的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。

    1.7 重組酶CBXYNA的表達(dá)和純化

    利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增cbxynA的ORF編碼序列。在序列 N端正(5’-CATGCCATGGCACACGTACACGTCCCG-3’)引入Xho I位點(diǎn),在C端(5’-CCGCTGAGGCAGGCTGCGAAAAGCCC-3’)引入 Nco I位點(diǎn)。

    將目的基因cbxynA經(jīng)Xho I和Nco I雙酶切后連接到pET-28a(+)載體并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)。對(duì)表達(dá)過程中何時(shí)加入IPTG的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、加入IPTG誘導(dǎo)后的溫度、誘導(dǎo)的時(shí)間及IPTG濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。收集菌體后用裂解液裂解,超聲波破碎細(xì)胞后離心收集上清粗酶液。用Ni柱純化粗酶液,先用2.5%wash&elution buffer對(duì)柱料進(jìn)行沖洗,通過A280檢測(cè)器對(duì)除雜蛋白情況進(jìn)行監(jiān)控,直至檢測(cè)器顯示沒有雜峰的出現(xiàn)。用wash&elution buffer對(duì)柱料進(jìn)行梯度洗脫,梯度分別為5%,10%,20%,40%,60%,80%,100%。并將對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間的蛋白進(jìn)行收集。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的酶蛋白。

    1.8 重組酶CBXYNA活力及酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

    以木聚糖為底物,采用DNS法測(cè)定酶活力。酶最適pH值和pH穩(wěn)定性測(cè)定緩沖液體系為pH值2.2~11。每種緩沖體系5個(gè)點(diǎn),共35個(gè)點(diǎn)。重組CBXYNA酶活力的測(cè)定在50℃下進(jìn)行,將常規(guī)方法中的緩沖液替換為上述不同pH體系的緩沖液,測(cè)定所得酶活力記為100%。pH穩(wěn)定性是將酶液稀釋,使酶液處于不同的緩沖體系中,50℃下保溫30 min后立即冰浴終止反應(yīng),之后按照DNS測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活力,以未經(jīng)保溫處理的重組木聚糖酶CBXYNA活力為100%,分別計(jì)算不同pH下的殘余相對(duì)酶活力。

    測(cè)定最適溫度時(shí),用最適pH緩沖液將酶稀釋一定比例,然后置于40~80℃的不同溫度下,反應(yīng)10 min,測(cè)定酶活力,以最大值為100%。溫度穩(wěn)定性的測(cè)定,將樣品與酶最適反應(yīng)緩沖溶液以一定比例混勻,置于不同溫度(50,55,60,65,70 ℃)中保溫不同時(shí)間(0,30 min,1 h,1.5 h,2 h,3 h,4 h,5 h)。定時(shí)取樣,測(cè)定樣品殘留酶活力,以未處理木聚糖酶活力作對(duì)照。

    考察的金屬離子 Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì) CBXYNA 酶活力的影響。酶對(duì)底物特異性的研究,添加1%(w/v)的燕麥木聚糖、樺木木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖在0.05 mol/L,pH 5.2的醋酸緩沖液中,反應(yīng)時(shí)間為10 min,反應(yīng)溫度為55℃條件下測(cè)定木聚糖酶活力。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 土壤宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及其篩選

    從土壤中提取總的DNA,經(jīng)純化濃縮后的23 kb以上的DNA的量約為6 μg。因土壤環(huán)境中得到的總DNA片段較長(zhǎng),不利于外源片段插入載體中。故采用Sau3A I酶對(duì)回收的土壤DNA片段進(jìn)行部分酶切,再用1%的瓊脂糖凝膠回收2~10 kb以內(nèi)的DNA片段約2 μg左右。土壤粗提DNA電泳圖如圖1所示。

    將酶切時(shí)間設(shè)置為1 h,每100 μL加入0.75 U的Sau3A I酶,使得土壤DNA的條帶分布在2~8 kb,符合構(gòu)建質(zhì)粒土壤宏基因組文庫(kù)。酶切之后的土壤DNA與pUC19載體經(jīng)T4連接酶連接后,導(dǎo)入到DH5α中。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板后獲得了大量宏基因文庫(kù)克隆子。從文庫(kù)中隨機(jī)提取10個(gè)克隆子并提取質(zhì)粒,用EcoR I和Hind III雙酶切之后,結(jié)果表明:質(zhì)粒間插入的外源酶切帶型差異顯著,文庫(kù)克隆片段隨機(jī)性較高。外源插入大小為1.5~4.5 kb,平均為 3 kb,粗略計(jì)算,宏基因組的庫(kù)容量為30 Mb。

    圖1 不同方法提取土壤DNA電泳圖Fig.1 Extraction and purification of DNA from soil by different methods

    圖2 土壤宏基因組文庫(kù)重組質(zhì)粒雙酶切分析Fig.2 The restriction analysis of recombinant plasmids from the soil metagenomic library

    隨后,基于功能策略篩選,采用剛果紅法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初篩,Cb5545克隆子在剛果紅平板上的透明圈如圖3所示。

    圖3 Cb5545克隆子初篩(a)及復(fù)篩(b)選平板中的透明圈Fig.3 Transparent rings of Cb5545 clone in primary screening(a)and screening(b)plate

    平板篩選結(jié)果表明:克隆子Cb5545具有水解木聚糖底物的活性,使以木聚糖為底物的平板經(jīng)剛果紅染色后產(chǎn)生了陽(yáng)性透明圈。隨后對(duì)篩選的克隆子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,取粗酶液采用DNS法測(cè)定發(fā)現(xiàn)其初始酶活力為12.09 U/mL。

    2.2 基因cbxynA序列分析

    將篩選得到的陽(yáng)性克隆子Cb5545測(cè)序,得到一段4 238 bp的DNA序列,并預(yù)測(cè)了該外源插入片段的所有可能開放閱讀框,其中開放閱讀框ORF10是一個(gè)822 bp長(zhǎng)的編碼木聚糖酶的完整的開放閱讀框,其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與來(lái)自Halobacteriaceae archaeon(古細(xì)菌屬)編碼的木聚糖酶的相似度最高也僅為45%,表明該序列是一條未知的新序列(GenBank登記號(hào):KY062986)。該基因編碼的產(chǎn)物由273個(gè)氨基酸組成,預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量為29.1 ku,等電點(diǎn)為5.2。

    2.3 重組酶CBXYNA原核表達(dá)優(yōu)化

    將目的基因cbxynA克隆到pET-28a(+)表達(dá)系統(tǒng)里進(jìn)行異源表達(dá)。對(duì)重組質(zhì)粒何時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)、加入IPTG后的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。最終的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明:培養(yǎng)5 h后,添加IPTG終濃度為0.7 mmol/L,在23℃下誘導(dǎo)25 h,獲得的最大酶活力為52 U/mL,較初始值提高了4.3倍。

    2.4 重組酶CBXYNA的純化

    CBXYNA經(jīng)硫酸銨鹽析和Ni-NTA純化結(jié)果如表1所示。硫酸銨鹽析和Ni-NTA純化后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證(圖5泳道2),將得到的電泳純級(jí)CBXYNA木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)特性研究。

    2.5 重組酶CBXYNA酶學(xué)性質(zhì)研究

    圖4 IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的菌體生長(zhǎng)曲線(a)及IPTG加入后的誘導(dǎo)時(shí)間(b)、誘導(dǎo)溫度(c)及誘導(dǎo)劑濃度(d)對(duì)CBXYNA酶活力影響Fig.4 Growth curve of muton for IPTG inducing(a)and Effect of IPTG inducing time(b),temperature(c),concentration(d)on CBXYNA enzyme activity

    表1 重組木聚糖酶CBXYNA的純化總結(jié)Table 1 Summary of purification recombinant CBXYNA

    圖5 CBXYNA純化過程的電泳圖和酶譜圖Fig.5 The SDS-PAGE electrophoresis and zymogram of recombinant CBXYNA

    當(dāng)以木聚糖為底物時(shí),CBXYNA酶促反應(yīng)的最適pH為5.2(圖6a),其pH穩(wěn)定性在pH 4.2到10.2之間,保溫30 min后殘余酶活仍能達(dá)到70%以上(圖6b)。CBXYNA的酶促反應(yīng)最適溫度為55℃(圖6c),在50~60℃條件下保溫30 min,殘余酶活力仍為80%以上(圖6d)。

    研究 Ca2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、K+和Na+、等不同金屬離子對(duì)重組木聚糖酶CBXYNA酶活力的影響,由圖7可知,Na+、 K+、Ca2+、Li+在1~7 mmol/L的范圍之內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用,而Mg2+則在1~3 mmol/L內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用,在5~7 mmol/L對(duì)酶有抑制作用。Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用,且抑制作用隨著金屬離子濃度的升高而增強(qiáng)。其中,Cu2+對(duì)酶的抑制作用最明顯,幾乎使其完全喪失酶活。金屬離子在微生物機(jī)體內(nèi)主要是作為酶活性中心的組成部分,維持生物大分子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。但是有些金屬離子對(duì)機(jī)體有不利影響,研究認(rèn)為半胱氨酸可以參與糖殘基-酶中間體的形成,而有些重金屬離子阻礙了這一過程,不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行,也可能是影響了酶與底物的結(jié)合及解離狀態(tài)。然而金屬離子影響酶活力的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

    進(jìn)一步探究CBXYNA酶的底物特異性,以樺木木聚糖的酶活力為對(duì)照100%,當(dāng)以水溶性玉米芯木聚糖作為底物時(shí),CBXYNA酶活力達(dá)到162%;以燕麥木聚糖為底物時(shí),酶活力為139%。以水不溶性玉米芯為底物時(shí),酶活力為74%;以麩皮為底物時(shí),其酶活力為56%(表2)。

    圖6 重組酶CBXYNA的酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 Enzymatic properties of the recombinant enzyme CBXYNA

    圖7 金屬離子對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of metal Ions on xylanase activity

    3 結(jié)論

    研究從土壤宏基因文庫(kù)中篩選并鑒定出一個(gè)木聚糖酶基因cbxynA,經(jīng)分析表明該基因是一段未知的新序列。隨后對(duì)該基因進(jìn)行克隆表達(dá),對(duì)其原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終獲得其最大酶活力為52 U/mL,較初始值提高了4.3倍。重組木聚糖酶 CBXYNA,其最適 pH為 5.2,pH在4.2到10.2之間時(shí)其酶活力在70%以上,有較好的pH穩(wěn)定性。CBXYNA的最適溫度為55℃,在50~60℃保溫30 min酶活力仍在80%以上,具較好的熱穩(wěn)定性。Na+、K+、Ca2+、Li+在1~7 mmol/L 的范圍之內(nèi)對(duì)酶有促進(jìn)作用,Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用,且抑制作用隨著金屬離子濃度的升高而增強(qiáng)。其中,Cu2+對(duì)酶的抑制作用最明顯,幾乎使其完全喪失酶活。當(dāng)該酶以水溶性玉米芯木聚糖、燕麥木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖、酶活力分別為162%,139%,74%,說明該CBXYNA更容易結(jié)合水解水溶性木聚糖底物。重組木聚糖酶CBXYNA有較好的pH穩(wěn)定性,可用于造紙、飼料、食品等工業(yè)應(yīng)用中。同時(shí)該酶以燕麥木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖為底物時(shí),酶活力相對(duì)較高,有較強(qiáng)的親和能力,可被用于水解可溶性木聚糖底物制備低聚木糖。

    表2 重組CBXYNA對(duì)不同水解底物的特異性Table 2 Specificity of CBXYNA towards different hydrolysis substrates

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