‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆與功能分析

蔣夢(mèng)婷，朱寧，龔洪泳，侯應(yīng)軍，余心怡，渠慎春

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因的克隆與功能分析

蔣夢(mèng)婷，朱寧，龔洪泳，侯應(yīng)軍，余心怡，渠慎春

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095）

【】對(duì)的亞細(xì)胞定位及表達(dá)特性進(jìn)行分析，并將轉(zhuǎn)化煙草，分析轉(zhuǎn)基因煙草的生理和形態(tài)指標(biāo)，為的深入研究提供理論基礎(chǔ)。以‘南通小方柿’高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中標(biāo)注的為原始序列（未發(fā)表），利用RT-PCR，3′RACE和5′ RACE技術(shù)從‘南通小方柿’中克隆得到的序列全長(zhǎng)。利用生物信息學(xué)分析其序列特征，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析在‘大方柿’及‘南通小方柿’5個(gè)不同物候期的表達(dá)特性以及在‘南通小方柿’不同組織中的表達(dá)特性，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA-GFP-1302-，并瞬時(shí)侵染煙草分析的亞細(xì)胞定位，通過(guò)構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過(guò)GUS染色、RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行鑒定；并將野生型和轉(zhuǎn)基因煙草移栽，于第一朵花開(kāi)放時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的株高、節(jié)間長(zhǎng)度、葉片長(zhǎng)寬比以及GA1和GA4含量。從‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的，DkGAI2核苷酸序列與獼猴桃（KF588651.1）、光皮燁（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、蘋(píng)果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度達(dá)72%-80%，具有DELLA蛋白家族特有的DELLA結(jié)構(gòu)域，屬于DELLA蛋白基因家族。編碼608個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為66.5 kD，理論等電點(diǎn)為5.54，不穩(wěn)定系數(shù)為50.41，無(wú)明顯疏水區(qū)，無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽。序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，與葡萄親緣關(guān)系最近。qRT-PCR結(jié)果顯示，在‘南通小方柿’5個(gè)不同物候期的表達(dá)量都高于‘大方柿’；在‘南通小方柿’不同組織中表現(xiàn)出組織表達(dá)特異性，其中，在老葉中表達(dá)量最高，其次為莖尖和幼葉，而在幼果中幾乎不表達(dá)。pCAMBIA-GFP-1302-融合蛋白的綠色熒光信號(hào)位于細(xì)胞核中，表明編碼蛋白位于細(xì)胞核。經(jīng)過(guò)GUS染色和RT-PCR檢測(cè)，共獲得5個(gè)轉(zhuǎn)煙草株系，轉(zhuǎn)基因煙草葉片GA1含量增加，GA4含量降低，GA1和GA4總含量降低，且轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)植株矮化、節(jié)間縮短、葉片長(zhǎng)寬比降低及花期延遲的表型。具有組織表達(dá)特異性，定位于細(xì)胞核，在‘南通小方柿’5個(gè)不同物候期的表達(dá)量均高于‘大方柿’。推測(cè)可能通過(guò)降低GA4的含量進(jìn)而引起植株矮化。

南通小方柿；；基因克??；亞細(xì)胞定位；組織特異性表達(dá)

0 引言

【研究意義】‘南通小方柿’（Linn. cv. Nantongxiaofangshi）作為珍稀矮生型柿品種之一，矮化性狀明顯，干性弱、樹(shù)姿開(kāi)張且沒(méi)有明顯主干，被認(rèn)為是一種優(yōu)良的適于矮化密植栽培的柿品種[1]。DELLA蛋白作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用，GA主要通過(guò)降解此蛋白來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。開(kāi)展‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因的克隆與功能分析，對(duì)深入研究功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】擬南芥中有5種DELLA蛋白，包括GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3[3]。Peng等[4]首次在擬南芥中克隆出GA不敏感型基因，并指出具有阻遏生長(zhǎng)的作用，而突變體對(duì)GA信號(hào)不敏感，植株表現(xiàn)出不正常的矮化。研究表明，DELLA蛋白參與了水稻、大麥、小麥、番茄、草莓及油菜的形態(tài)建成，包括莖的伸長(zhǎng)，幼苗彎鉤結(jié)構(gòu)的形成，單個(gè)小葉的形成及匍匐莖的形成[5-9]。如油菜中的DS-3可編碼一種DELLA蛋白，負(fù)向調(diào)控油菜莖的伸長(zhǎng)[10]。DELLA蛋白的功能還包括：抑制或延遲植物的開(kāi)花[11]、減緩植物的避陰反應(yīng)[12]、促進(jìn)豆科植物與固氮根瘤菌的共生[13]、促進(jìn)番茄保衛(wèi)細(xì)胞氣孔關(guān)閉[14]、減緩由年齡引起的葉片衰老[15]、參與抵抗鹽脅迫等逆境等重要生命過(guò)程[16]、參與抵抗水稻病原體的免疫反應(yīng)[17]。依據(jù)DELLA蛋白N端的保守結(jié)構(gòu)域，現(xiàn)已從其他物種中分離出了多個(gè)DELLA蛋白基因，如擬南芥中的和[4,18]、小麥及玉米中的（）和（）[19]、水稻中的[20]、大麥中的[21]、紫花苜蓿中的[22]、莧菜中的[23]、蘋(píng)果中的[24]、大巖桐中的[25]等。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)，柿屬植物中與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的研究較少見(jiàn)，尤其是‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因的研究更是少見(jiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從‘南通小方柿’中克隆得到全長(zhǎng)序列，分析對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為今后的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年5月至2019年4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘南通小方柿’和‘大方柿’，以君遷子為砧木的3年生嫁接苗。轉(zhuǎn)基因所使用的煙草K326種子和供瞬時(shí)侵染用的本氏煙草（）種子均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 各種酶及生化試劑 各種限制性?xún)?nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、Prime STAR GXL DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。T4DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司。植物RNA提取試劑盒購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司、植物DNA提取試劑盒購(gòu)自南京天根生物技術(shù)有限公司。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)于Clontech公司（大連，中國(guó)）。

1.1.3 菌株及載體 pMD19-T Vector載體購(gòu)于大連寶生物科技有限公司，pEASY-Blunt載體購(gòu)自TransGenBiotech，大腸桿菌菌株DH-5α、農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，pCAMBIA1302-GFP、PBI121載體均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1中間片段的克隆 以‘南通小方柿’葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中標(biāo)注的序列為原始序列（未發(fā)表），利用NCBI Primer-BLAST在線(xiàn)設(shè)計(jì)特異引物F和R，產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 521 bp。引物序列見(jiàn)表1，試驗(yàn)所用引物均由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 ‘南通小方柿’DkGAI2克隆、表達(dá)及功能分析所用引物

以新鮮采取的‘南通小方柿’幼嫩葉片為材料，并按照植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟提取葉片總RNA，濃度儀檢測(cè)RNA的純度和濃度，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。

（1）PCR反應(yīng)體系為：5×GXL Buffer 5 μL，dNTP 2.0 μL，-F 0.5 μL，-R 0.5 μL，模板（cDNA） 1 μL，PrimeSTAR GXL 0.5 μL，用超純水補(bǔ)足至25 μL。

（2）PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 1 min 40 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外下拍照，切膠并利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。將回收產(chǎn)物與平末端克隆載體pEASY-Blunt 連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。步驟如下：

①連接：吸取PCR產(chǎn)物4.5 μL，pEASY-Blunt 克隆載體0.5 μL，25℃反應(yīng)15—20 min。

②轉(zhuǎn)化：取-70℃保存的大腸桿菌DH-5α，冰上融化，至半融化狀態(tài)時(shí)加入連接產(chǎn)物，用槍頭輕輕吹打混勻，冰浴30 min，42℃熱激90 s，于冰上放置2 min，立即加入700 μL無(wú)抗性的液體LB，混勻后于250 r/min、37℃搖床培養(yǎng)1 h。

③涂板：6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min，棄去上清液，吸取100 μL左右菌液均勻涂于含50 mg·L-1Km抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)8—12 h。

④陽(yáng)性克隆檢測(cè)：挑取白色單菌落，接種在含有50 mg·L-1Km的LB液體培養(yǎng)基中，250 r/min、37℃搖菌培養(yǎng)6—8 h，菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。

⑤測(cè)序驗(yàn)證：取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液，送南京擎科生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.23′端的獲得 cDNA的獲得同1.2.1，其中反轉(zhuǎn)錄時(shí)將Ramdom Primer替換為接頭引物3′ RACE Adapter（GCGAGCACAGAATTAATACGAC TCACTATAGGT12VN），此外，將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度從37℃調(diào)至 42℃，反轉(zhuǎn)錄酶的失活溫度從85℃調(diào)至95℃。以通用外側(cè)引物與特異外側(cè)引物3′ GSP-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：cDNA 1 μL，5×GXL buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，PrimeSTAR GXL酶0.5 μL，超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR 程序?yàn)椋?8℃ 4 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后做模板，以通用內(nèi)側(cè)引物與特異內(nèi)側(cè)引物3′ GSP-2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和程序同上。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，轉(zhuǎn)化后取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。連接轉(zhuǎn)化步驟同1.2.1。

1.2.35′端的獲得 cDNA的獲得參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，Cat. Nos.634923 & 634924）。利用通用外側(cè)引物UPM和特異外側(cè)引物5′ GSP-1進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序如下：5×GXL buffer 5 μL，dNTP 2 μL，cDNA 1.0 μL，5′ GSP-1 0.5 μL，UPM 1 μL，PrimeSTAR GXL酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足，終體積25 μL。反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；68℃ 7 min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后做模板，以?xún)?nèi)側(cè)引物5′ GSP-2與NUP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和程序同上。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，轉(zhuǎn)化后取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。連接轉(zhuǎn)化步驟同1.2.1。

1.2.4序列分析 利用DNAMAN軟件及NCBI將測(cè)序驗(yàn)證正確的3部分片段進(jìn)行拼接，查找的ORF（最大開(kāi)放閱讀框），并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST對(duì)其核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行序列相似性分析；利用protparam（http://web. expasy.org/protparam/）對(duì)氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；利用SignalP（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）在線(xiàn)分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；利用ProtScale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/ protscale.pl）軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的疏水性；利用TMHMM Server V.2.0在線(xiàn)程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN對(duì)編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5的亞細(xì)胞定位

1.2.5.1瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建 在序列的兩端引入I和I酶切位點(diǎn)，提取正確克隆的質(zhì)粒。與pCAMBIA-GFP-1302質(zhì)粒同時(shí)用I和I進(jìn)行雙酶切，酶切體系（20 μL）為載體質(zhì)粒10 μL、I 1 μL、I 1 μL、BSA緩沖液2 μL、10×K Buffer 2 μL、ddH2O 4 μL。分別回收載體片段和目的基因片段，用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α，PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，送公司測(cè)序，提取正確克隆的質(zhì)粒。從而得到pCAMBIA-GFP-1302-瞬時(shí)表達(dá)載體。

1.2.5.2 瞬時(shí)侵染本氏煙草葉片 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：取保存于-70℃的農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，掌心融化，處于半融化狀態(tài)后置于冰上，待其完全融化后，吸取1 μL pCAMBIA-GFP-1302/質(zhì)粒于EHA105感受態(tài)中，冰浴5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min，立即于超凈工作臺(tái)中加入700 μL不含激素的LB液體培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)2—3 h，6 000 r/min離心1 min收集菌液，棄上清，吸取100 μL左右的菌液均勻涂布于含50 mg?L-1Km和25 mg?L-1Rif的LB固體平板上，28℃倒置培養(yǎng)48—72 h。重懸浮液的配制：10 mmol?L-1MgCl2和10 mmol?L-1乙磺酸（EMS），兩種藥品單獨(dú)溶解后混合，高壓滅菌處理后，于超凈工作臺(tái)中冷涼后加入100 μmol?L-1的AS（乙酰丁香酮），密封好待用。菌液活化：吸取1 mL小搖陽(yáng)性菌液（含EHA105重組質(zhì)粒）于50 mL含50 mg?L-1Km的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值約為0.5時(shí)，5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，于超凈工作臺(tái)棄去上清液，加入不含激素的LB液體沖洗菌塊，盡量洗去菌體上的激素，5 000 r/min離心10 min后收集菌塊，并加入同等體積的重懸浮液，密封后于28℃、200 r/min培養(yǎng)2 h，室溫靜置2 h后侵染本氏煙草。注射：選取培養(yǎng)2—4周齡的本氏煙草植株，每株選2—3片葉，注射前澆足水分，于兩葉脈之間注射。葉片下表片事先用針尖頭輕戳一孔，將注射器口對(duì)準(zhǔn)所戳小孔，并將注射過(guò)的葉片做好標(biāo)記，注射后，葉片會(huì)出現(xiàn)濕潤(rùn)的現(xiàn)象，注射完畢后立即放入培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)16 h，后正常光照，約3 d后，于激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察表達(dá)情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分別于展葉期（2018年4月20日）、枯頂期（2018年5月16日）、開(kāi)花期（2018年5月27日）、生理落果期（2018年6月11日）和果實(shí)著色期（2018年9月13日）對(duì)‘大方柿’和‘南通小方柿’的葉片進(jìn)行取樣，并于2018年3—10月選取‘南通小方柿’不同部位的組織：由頂而下第3、4片幼葉，幼嫩的莖尖，由下往上第3、4片老葉以及幼嫩的果實(shí)，對(duì)‘南通小方柿’和‘大方柿’中5個(gè)不同物候期的表達(dá)特性及在‘南通小方柿’不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行檢測(cè)，以柿為內(nèi)參基因，利用Beacon Designer設(shè)計(jì)特異引物-YG-F和- YG-R（表1）。qRT-PCR 反應(yīng)體系為：稀釋cDNA 1 μL，上、下游引物各 0.2 μL，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10 μL，ddH2O 8.6 μL。反應(yīng)條件為95℃ 4 min；95℃ 25 s，60℃ 20 s，72℃ 43 s，40個(gè)循環(huán)。每處理重復(fù)3次，根據(jù)2?ΔΔCt公式計(jì)算結(jié)果，通過(guò)SPSS軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差和差異顯著性。

1.2.7 表達(dá)載體PBI121-的構(gòu)建 含酶切位點(diǎn)ORF片段的擴(kuò)增：根據(jù)PBI121載體的酶切位點(diǎn)和中不含有的酶切位點(diǎn)，在開(kāi)放閱讀框特異引物上、下游的5′端分別引入I（TCTAGA）和I（CCCGGG）酶切位點(diǎn)序列。引物序列如下：

F：5′-GC/TCTAGA/ATGAAGCGCGACC GCCGCA-3′；

R：5′-TCC/CCCGGG/TCACCTCTGGTG GGTCTGGA-3′。

以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，5×GXL buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，PrimeSTAR GXL酶0.5 μL，超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR程序?yàn)椋?8℃ 4 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行紫外拍照檢測(cè)，并切膠回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。連接轉(zhuǎn)化步驟同1.2.1。

PBI121-表達(dá)載體的構(gòu)建：將PBI121載體質(zhì)粒和經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆載體質(zhì)粒同時(shí)用I和I進(jìn)行雙酶切。酶切體系（20 μL）為載體質(zhì)粒10 μL、I 1 μL、I 1 μL、BSA緩沖液2 μL、10×T Buffer 2 μL、ddH2O 4 μL。所有試劑均在冰上進(jìn)行操作，并于37℃酶切反應(yīng)2—3 h，將酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，分別回收載體片段和目的基因片段，將回收后的大小片段與T4DNA連接酶于16℃連接12 h，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，連接轉(zhuǎn)化步驟同1.2.1。利用基因特異引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，送生物公司測(cè)序。將測(cè)序正確的PBI121-重組質(zhì)粒利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。

1.2.8 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定 用培養(yǎng)至OD600值約為0.5的陽(yáng)性農(nóng)桿菌單菌落菌液侵染切下的K326煙草葉片，侵染時(shí)間5 min，接種于共培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3 d，用無(wú)菌水洗滌3次，無(wú)菌濾紙吸干水分，接種于含50 mg·L-1Km（卡那霉素，Kanamycin）的篩選培養(yǎng)基中，兩周換一次培養(yǎng)基，直至長(zhǎng)出抗性芽。轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定如下：（1）GUS染色：在超凈工作臺(tái)上剪取轉(zhuǎn)基因煙草及野生型煙草的葉片于1.5 mL離心管中，加入200 μL GUS染液以浸沒(méi)檢測(cè)葉片，37℃下染色6—12 h，用50%乙醇脫色30 min后用75%乙醇脫盡綠色，拍照獲取檢測(cè)結(jié)果。（2）RT-PCR檢測(cè)：對(duì)于GUS染色呈藍(lán)色的株系，進(jìn)一步提取其葉片的RNA，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并于超微量濃度儀下檢測(cè)RNA的濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，煙草內(nèi)參基因檢測(cè)模板質(zhì)量，以基因特異引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后一輪72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.15 μL，超純水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)結(jié)束，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.2.9 轉(zhuǎn)基因煙草GA1和GA4含量的測(cè)定 取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草由頂而下的第4、5片完全展開(kāi)葉0.5 g。采用ESI-HPLC-MS/MS方法測(cè)定GA1、GA4的含量。

1.2.10 轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的測(cè)定 選取移栽于室外4周的轉(zhuǎn)基因與野生型煙草的中部第4、5片葉，提取葉綠素。參照李合生[26]的方法提取，并使用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草經(jīng)過(guò)煉苗后，同時(shí)移栽定植于溫室，于第一朵花開(kāi)放時(shí)進(jìn)行株高、節(jié)間長(zhǎng)度等形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)株系選取3個(gè)重復(fù)單株進(jìn)行測(cè)量。

1.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與序列分析

從‘南通小方柿’中克隆得到了827 bp的。生物信息學(xué)分析表明，核苷酸序列與獼猴桃（KF588651.1）、光皮燁（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、蘋(píng)果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的一致性達(dá)72%—80%。編碼608個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為66.5 kD，理論等電點(diǎn)5.54，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為50.41。編碼的蛋白質(zhì)無(wú)明顯疏水區(qū)，無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽序列。具有DELLA蛋白家族特有的DELLA結(jié)構(gòu)域，屬于DELLA蛋白基因家族。此外，編碼的氨基酸與葡萄（AEK06229.1）、光皮燁（AVP41333.1）、湖北海棠（ABL61270.1）、蘋(píng)果（ADH53778.1）、砂梨（AMZ00185.1）具有較高的相似性，序列一致性達(dá)65%—71%（圖1）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，與葡萄、毛白楊、獼猴桃、蘋(píng)果的親緣關(guān)系較近（圖2）。

2.2 DkGAI2的物候期表達(dá)特性

從圖3中可以看出在‘大方柿’和‘南通小方柿’5個(gè)不同物候期中存在表達(dá)差異。在‘南通小方柿’5個(gè)物候期的表達(dá)量均高于大方柿，且隨著物候期的推進(jìn)，兩品種呈同樣的下降趨勢(shì)（圖3）。

2.3 DkGAI2的組織表達(dá)特異性

利用qRT-PCR方法檢測(cè)在‘南通小方柿’不同組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，在老葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他組織中的表達(dá)量，其次是幼葉和莖尖，而在幼果中幾乎不表達(dá)（圖4）。

2.4 DkGAI2基因的亞細(xì)胞定位

結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），pCAMBIA-GFP-1302-綠色熒光蛋白信號(hào)分布在細(xì)胞核中，而pCAMBIA- GFP-1302綠色熒光蛋白信號(hào)分布在細(xì)胞膜上，說(shuō)明編碼蛋白定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，具有轉(zhuǎn)錄因子的特征，是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，且在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的整合作用。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

經(jīng)過(guò)30 d的篩選培養(yǎng)，共獲得33個(gè)煙草抗性苗，GUS檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)煙草株系中有6個(gè)GUS染色呈藍(lán)色，而野生型株系未染上藍(lán)色（圖6-A）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到擴(kuò)增條帶，在6株GUS染色為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)煙草株系中，有5個(gè)株系擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的特異條帶，膠回收、克隆測(cè)序表明，所擴(kuò)增條帶為目的基因序列。初步證明已成功在煙草轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)（圖6-B）。

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)測(cè)定

轉(zhuǎn)基因煙草株系（L-2、L-3、L-11）葉片中GA1含量高于野生型，其中，野生型的GA1含量為1.22 ng?g-1，L-2、L-3和L-11株系GA1的含量分別為野生型的1.43、1.23和1.35倍。而轉(zhuǎn)基因株系中GA4含量均低于野生型，其中，野生型GA4含量為4.66 ng?g-1，而轉(zhuǎn)基因株系L-2、L-3、L-11的GA4含量分別為野生型的34.3%、24.7%和25.8%。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系中GA1和GA4總含量均低于野生型，其中，野生型煙草GA1和GA4總含量為5.88 ng?g-1，而轉(zhuǎn)基因株系L-2、L-3和L-11的GA1和GA4總含量分別為野生型的57%、45%、48%（表2）。

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草葉片的葉綠素含量均高于野生型，植株葉片顏色更深綠。其中，野生型煙草葉片的葉綠素含量為0.78 mg?g-1，轉(zhuǎn)基因株系L-2、L-3、L-11的葉綠素含量分別為野生型的1.51、1.43和1.67倍。

圖1 DkGAI2編碼氨基酸同源性比對(duì)

圖2 DkGAI2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

A：展葉期Leaf expanding period；B：枯頂期 Tip buds dying period；C：開(kāi)花期 Flowering period；D：生理落果期 Physiological fruit-falling period；E：果實(shí)著色期 Fruit coloring period

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05). The same as below

A：pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2 fusion protein；B：pCAMBIA-GFP-1302載體pCAMBIA-GFP-1302 vector

M：2000 DL Marker；1—6（A、B）：轉(zhuǎn)DkGAI2煙草株系 Transgenic tobacco plants；WT（A）、7（B）：野生型煙草 Wild-type tobacco；8（B）：PBI121-35S-DkGAI2重組質(zhì)粒 PBI121-35S-DkGAI2 vector

2.7 轉(zhuǎn)基因煙草的形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出花期延遲、植株矮化、節(jié)間縮短等表型特征（圖7）。其中，野生型的株高為31.5 cm，轉(zhuǎn)基因株系L-2、L-3、L-11的株高分別為7.7、10.2和9.1 cm，分別為野生型的24.4%、32.4%和28.8%。此外，野生型的節(jié)間長(zhǎng)度為17.5 cm，轉(zhuǎn)基因株系L-2、L-3、L-11的節(jié)間長(zhǎng)度分別為野生型的25.7%、41.1%和37.1%。且轉(zhuǎn)基因株系葉片長(zhǎng)寬比均顯著低于野生型，其中以L(fǎng)-11株系的葉片長(zhǎng)寬比1.4為最小，而野生型的葉片長(zhǎng)寬比為2.6（表2）。

3 討論

本研究中能使煙草表現(xiàn)出矮化表型， 這與前人擬南芥轉(zhuǎn)化煙草的研究結(jié)果一致[27]，且轉(zhuǎn)煙草植株表現(xiàn)出葉色深綠的表型，與前人關(guān)于擬南芥突變體的表型研究相同[4]，且在‘南通小方柿’和‘大方柿’5個(gè)不同物候期的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異，在‘南通小方柿’不同物候期的表達(dá)量均高于‘大方柿’，說(shuō)明很有可能參與‘南通小方柿’矮化性狀的形成過(guò)程。矮化是作物育種中最有價(jià)值的性狀之一，矮化品種抗倒伏，易管理，并與增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)相關(guān)。高等植物體內(nèi)與赤霉素（GA）相關(guān)的矮化有兩類(lèi)：一類(lèi)與其合成代謝有關(guān)，稱(chēng)之為合成型矮生突變體。此突變體主要是由于GA合成酶異常而引起植株體內(nèi)GA缺乏，從而導(dǎo)致植物出現(xiàn)矮化[28]。另一類(lèi)與GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，被稱(chēng)為GA響應(yīng)型突變體。根據(jù)其表型特征又可分為細(xì)長(zhǎng)型響應(yīng)突變體和GA不響應(yīng)矮化型突變體。前者表現(xiàn)出施用過(guò)量GA的莖和葉過(guò)度生長(zhǎng)、葉色淺綠、開(kāi)花提前等表型特征，如擬南芥[29]；后者與GA合成突變體的表型相似，這類(lèi)突變體表現(xiàn)出矮化、葉色深綠、花期延遲等表型特征，且外源GA處理并不能使其恢復(fù)野生表型，如擬南芥（GA-insensitive-1）突變體、小麥(Reduced height 1-3) 、玉米和突變體[30]，研究表明小麥和以及玉米與擬南芥赤霉素不敏感基因（）屬于直系同源物[5]，本研究中，矮化的煙草株系的葉片長(zhǎng)寬比與對(duì)照相比降低。

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

表2 轉(zhuǎn)DkGAI2煙草生理及形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

‘南通小方柿’是目前在江蘇省南通市發(fā)現(xiàn)的唯一具有矮生性狀的柿品種，與‘大方柿’相比，其具有樹(shù)冠矮小、新梢生長(zhǎng)量小、適應(yīng)強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)[1]。生物活性GAs是一組二萜酸，可在植物的整個(gè)生命周期中調(diào)節(jié)不同的發(fā)育過(guò)程。DELLA蛋白作為GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中響應(yīng)生長(zhǎng)的關(guān)鍵阻遏物，屬于GRAS（GAI、RGA、SCARECROW）家族的蛋白亞家族，含有保守的C末端GRAS結(jié)構(gòu)域，而GRAS蛋白家族中GAI和RGA因其N(xiāo)末端均具有DELLA和VHYNP兩個(gè)高度保守的酸性結(jié)構(gòu)域，又被歸類(lèi)于DELLA蛋白[31]。在擬南芥中，RGA（由repressor of ga1-3編碼）和GAI（由GA insensitive編碼）是調(diào)控莖伸長(zhǎng)的主要抑制因子[5]。GAI和RGA的DELLA結(jié)構(gòu)域的突變使其對(duì)GA信號(hào)引起的降解產(chǎn)生抗性，并導(dǎo)致GA不敏感的矮化表型[19]。本研究中，含有高度保守的DELLA結(jié)構(gòu)域，屬于DELLA蛋白家族。且編碼的氨基酸與葡萄、蘋(píng)果、砂梨、芝麻的同源性達(dá)67%—75%，具有較高的相似性，說(shuō)明在不同物種間的保守性較高。

關(guān)于DELLA蛋白的時(shí)空表達(dá)模式，不同植物DELLA蛋白的表達(dá)部位有所不同，和主要分布在棉花的營(yíng)養(yǎng)器官以及纖維起始期和延伸期的胚珠中，其參與了棉花纖維的形成[32]；主要分布在大豆的葉、胚組織和花等部位[33]；主要分布于梅的莖和種子中[34]；主要表達(dá)于葡萄莖尖和葉片等部位[35]；主要分布在黃瓜莖和雄花芽中[36]。在‘南 通小方柿’老葉中表達(dá)最高，其次為幼葉和莖尖，而在幼果中幾乎不表達(dá)，這與前人研究結(jié)果基本一致[33-36]。

DELLA蛋白是一類(lèi)調(diào)控所有GA反應(yīng)的保守的生長(zhǎng)抑制因子[37]。近年來(lái)，隨著蛋白基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的研究，亞細(xì)胞定位、蛋白與蛋白之間的互作等研究越來(lái)越受到關(guān)注，其中，基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位研究已成為功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容。基因所編碼的蛋白質(zhì)序列中包含了該蛋白的定位信息，并在細(xì)胞中的特定部位發(fā)揮作用[38]。研究表明，DELLA蛋白定位在細(xì)胞核，發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄因子的功能。且具有轉(zhuǎn)錄因子的特征，定位于細(xì)胞核，本研究中定位于細(xì)胞核，與前人研究結(jié)果一致[39]，說(shuō)明是一類(lèi)定位在核內(nèi)的負(fù)轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

GAI因其N(xiāo)末端具有DELLA和VHYNP兩個(gè)高度保守的酸性結(jié)構(gòu)域，屬于DELLA蛋白家族成員中的一員。是一類(lèi)生長(zhǎng)抑制因子，負(fù)向調(diào)控莖的生長(zhǎng)。GA是植物體內(nèi)重要的內(nèi)源激素之一，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義，GA1、GA3、GA4和GA7為植物體內(nèi)有生物活性的GA[40]。本研究中，過(guò)表達(dá)煙草株系的GA1和GA4總含量均低于對(duì)照，這可能是引起煙草植株出現(xiàn)矮化表型的主要原因。此外，轉(zhuǎn)基因煙草植株的GA1含量上升，GA4含量降低，說(shuō)明主要是通過(guò)降低GA4的含量進(jìn)而引起植株矮化。

4 結(jié)論

從‘南通小方柿’中克隆得到1 827 bp的，其含有高度保守的DELLA結(jié)構(gòu)域，屬于DELLA蛋白家族。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，DkGAI2與毛白楊、蘋(píng)果、梅親緣關(guān)系較近。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明DkGAI2定位于細(xì)胞核。在老葉中表達(dá)量最高，其次為幼葉和莖尖，而在幼果中表達(dá)量最低。物候期表達(dá)分析結(jié)果表明在‘南通小方柿’5個(gè)不同物候期的表達(dá)量均高于‘大方柿’。過(guò)表達(dá)的煙草葉片GA1含量增加，GA4含量降低，GA1和GA4總含量降低，且轉(zhuǎn)基煙草表現(xiàn)出植株矮化、節(jié)間縮短、葉片長(zhǎng)寬比降低及花期延遲等現(xiàn)象。

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Cloning and Function Analysis of Gibberellin InsensitiveGene in Nantongxiaofangshi (Linn. cv. nantongxiaofangshi)

JIANG MengTing, ZHU Ning, GONG HongYong, HOU YingJun, YU XinYi, QU ShenChun

（College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095）

【】In this study, the full-length sequence of gibberellin insensitive gene () was obtained from the leaf of Nantongxiaofangshi (Linn. cv. nantongxiaofangshi), named as. The subcellular localization and expression characteristics ofgene were analyzed. Thengene was transformed into plant tobacco, and the morphological and physiological indicators of the transgenic tobacco plants were determined. Our study would provide a theoretical basis for the future research ofgene.【】The full-length sequence ofgene was cloned from Nantongxiaofangshi by RT-PCR, 3’ RACE and 5’ RACE using the labeledgene as the original sequence of high-throughput transcriptome sequencing of Nantongxiaofangshi (Unpublished). Sequence characteristics were analyzed by bioinformatics. The expression characteristics ofgene in five different phenological stages of Dafangshi and Nantongxiaofangshi, and the expression level ofgene in different tissues of Nantongxiaofangshi was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). The transient expression vector pCAMBIA-GFP-1302-was constructed and was transiently infected with tobacco to analyze the subcellular localization ofgene.gene driven by the 35S promoter was constructed and delivered into plant tobacco by Agrobacterium-mediated transformation approach. Transgenic plants were identified by using GUS staining and RT-PCR. After transplanting, the plant height, internode length, leaf aspect ratioand the content of GA1and GA4in transgenic tobacco plants were measured at the first flowering stage.【】1 827 bp ofwas cloned from Nantongxiaofangshi, the nucleotide sequence ofgene shared 72%-80% in homology compared with kiwifruit (KF588651.1), light skin (MF149049.1), pear (KX078214.1), apple (FJ535245.1) and grape (MG738718.1).gene containing DELLA and GRAS conserved special domain, belonging to DELLA protein gene family.gene encoding a putative protein about 608 amino acids, the relative molecular mass ofgene was 66.5 KD, the theoretical isoelectric point was 5.54, and the instability coefficient iwas 50.41, without obvious hydrophobic region, without transmembrane domain and signal peptide. Phylogenetic analysis showed that thegene had close relationship with grape. qRT-PCR result showed that the expression level ofgene in five different phenological stages of Nantongxiaofangshi was higher than that of Dafangshi.gene showed tissue expression specificity in different tissues of Nantongxiaofangshi, which had the highest expression in old leaves, followed by young leaves and shoot tips, while it had the lowest expression in fruitlet. The green fluorescent signal of the pCAMBIA-GFP- 1302-fusion protein was located in the nucleus, indicating thatgene localized in the nucleus. After GUS staining and RT-PCR detection, 5 transgenic tobacco lines ofgene were obtained. The GA1content of transgenic tobacco leaves were increased, the GA4content were decreased, the total content of GA1and GA4weredecreased, and the transgenic tobacco plants showed plant dwarfing phenotypes with shortened internodes, reduced leaf aspect ratio, and delayed flowering.【】genehad tissue expression specificity;gene localized in the nucleus, the expression level ofgene in Nantongxiaofangshi was higher than that of Dafangshi at the five different phenological periods. It was speculated thatmay cause plant dwarfing by reducing GA4content.

Nantongxiaofangshi;; gene cloning; subcellular localization; tissue specific expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.012

2019-04-18；

2019-07-25

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201203047）

蔣夢(mèng)婷，E-mail：2016104025@njau.edu.cn。

渠慎春，E-mail：qscnj@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）