馬鈴薯組織培養(yǎng)技術(shù)

劉志強

一、馬鈴薯的組織培養(yǎng)

1、種薯的莖尖脫毒

植物組織培養(yǎng)也叫PlantTissueCulture，廣義指在特定條件下，植物生長過程中，將離體的植物組織、細胞或原生質(zhì)體，通過人工培養(yǎng)手段，促進其分化與生長，并在環(huán)境與技術(shù)的控制下，促使植物完成完整植株，過程生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的技術(shù)。因為組織培養(yǎng)過程需要脫離母體完成，因此植物組織培養(yǎng)也叫離體培養(yǎng)。狹義指特定條件下，植物中的形成層、葉肉組織、薄壁組織、胚乳等部分，通過培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的植株，也是對植物器官組織的再培養(yǎng)，通過分化過程變成新的植物。

選擇產(chǎn)量較高或抗病能力較強的塊莖洗凈后，在32℃下催芽或自然發(fā)芽。當塊莖出芽長約30厘米時，切取帶頂芽或側(cè)芽的莖段約10～15厘米備用。將莖尖先用自來水沖洗干凈后，用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞浸泡8～10min，然后用無菌水沖洗3～4遍后，在顯微鏡下剝?nèi)蓚€葉原基的莖尖接種到裝有脫毒培養(yǎng)基的試管斜面上，每個試管內(nèi)接種一塊愈傷組織，在25℃左右的培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。脫毒培養(yǎng)基一般為MS培養(yǎng)基中加入0.5mg·L-16-BA、0.1mg·L-1GA3和0.1mg·L-1NAA。觀察其生長狀況，剔除污染及未成活的試管苗。

2、試管苗擴繁

配制好MS培養(yǎng)基后，趁熱分裝入三角瓶中，進行高壓滅菌。觀察3～5天，剔除污染的試管后，準備接種。將工作服、套袖、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等進行高壓滅菌。將拖鞋及滅菌好的工作服放入緩沖間，對接種室的空間進行熏蒸消毒，每接種一個星期左右熏蒸一次。將盛裝75%的酒精瓶放在超凈工作臺附近，在工作臺內(nèi)放入酒精燈、打火機、浸泡的酒精棉球、滅菌器等所需物品，每次接種前需將超凈工作臺用紫外燈進行殺菌半小時左右，20min后工作人員方可進入。

接種人員先換上拖鞋、剪掉手指甲、用香皂洗凈雙手后，進入到緩沖間內(nèi)。換上拖鞋及工作服后，進入接種室，用75%的酒精對雙手、套袖進行噴霧消毒，然后就座于超凈工作臺前，點燃酒精燈，用酒精棉球?qū)﹄p手及臺面進行消毒，將試管先用酒精棉球擦拭，然后用酒精燈輕微灼燒試管口及棉塞，在酒精燈火焰下10cm以內(nèi)拔掉棉塞，將鑷子在酒精燈火焰下灼燒，帶晾涼后夾出試管苗，用剪刀剪掉剩余培養(yǎng)基后，將試管苗放在培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿在酒精燈附近10cm內(nèi)。將剪刀進行酒精燈火焰灼燒晾涼后，用剪刀將試管苗剪為數(shù)段，每段要留1片小葉。將帶有培養(yǎng)基的三角瓶先用酒精棉球擦拭，然后在酒精的火焰下對瓶口進行消毒，稍涼片刻，用鑷子將試管苗在酒精燈火焰下10cm以內(nèi)接入到三角瓶內(nèi)，每瓶接種10段左右，火焰封口后，貼上標簽，標簽上要標注接種時間、品種及接種人。重復此操作直至將培養(yǎng)皿內(nèi)的苗全部接完后，將培養(yǎng)皿用酒精棉球擦拭，在酒精燈火焰下灼燒后放回原處，進行下一個試管苗或另一個品種的接種操作。

接種結(jié)束后，將接種好的三角瓶放到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，25℃左右，每天用照明燈補光，光照16h，觀察其生長狀況，剔除污染及未成活的試管苗。一個月左右后進行下一次組織擴繁。

3、壯苗及生根培養(yǎng)

馬鈴薯組織培養(yǎng)時，增加細胞分裂素濃度，可以促進增殖系數(shù)的提升。但隨著增殖系數(shù)的增多，會抑制增殖芽的生長趨勢，不定芽更加細小，不能進行下一步生根培養(yǎng);即使可以進行下一步，成活率也會降低，還需另外進行壯苗培養(yǎng)。馬鈴薯的壯苗培養(yǎng)基為1/3MS+0.05mg·L-1NAA。

生根培養(yǎng)是使無根苗生根形成完整植株的過程，這個過程的目的就是使組培苗生長出濃密而粗壯的不定根，以提高組培苗對外界環(huán)境的適應力及馴化移栽的成果率，獲得更多高質(zhì)量的商品苗。馬鈴薯組培苗的生根培養(yǎng)是將未生根的組培苗轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)使其生根的過程。馬鈴薯的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.20mg·L-1NAA，適當加大植物生長素的用量，使其快速生根。

4、煉苗及移栽

馬鈴薯組培苗經(jīng)過生根培養(yǎng)后，便可出瓶移栽。移栽后的組培苗需在特定條件下，如無菌條件、營養(yǎng)、溫度、光照、濕度等，都有較高的要求，要想植物移栽后的生長滿足生長條件，就需要人工創(chuàng)造條件。后期還需使用出瓶種植，讓植物接觸自然環(huán)境，與人工環(huán)境有較大差距，如溫度與濕度等，改變了人為的條件，短時間中組培苗適應不能適應。因此，組培苗必須移出培養(yǎng)室，在室溫下煉苗3-5天。

移栽前一天揭開封口膜。移栽時，小心的用手洗去根部附著的培養(yǎng)基，水溫在22℃左右，去掉培養(yǎng)基的苗再用清水洗兩遍，要求認真細心，避免折斷薯苗，清洗后的薯苗再置于一定濃度的殺菌劑溶液中浸泡5min后，立即移栽。按6～8cm的株距移栽入無土培養(yǎng)的基質(zhì)上，擺苗要仔細，將苗的根系舒展好，覆土后可稍加鎮(zhèn)壓以提墑。移栽后澆透水，注意遮蔭保濕，基質(zhì)在使用前要用高錳酸鉀進行消毒，不易過濕，以防爛苗。觀察移栽苗的生長狀況，及時剔除未成活的組培苗，進行種植的常規(guī)管理。

二、馬鈴薯組織培養(yǎng)中的污染原因及控制措施

1、組培苗污染

產(chǎn)生組培苗污染的原因很多，如組織培養(yǎng)附近空氣環(huán)境清潔度不足、過濾設(shè)備設(shè)施失效、相關(guān)器具與器皿中含有其他菌群、植物操作過程不正確等等。造成組培苗污染的病原有很多，主要有細菌、真菌、內(nèi)源菌等。其中細菌的污染以芽孢桿菌最為普遍、嚴重，對其處理主要使用高壓滅菌或者消毒手段。組培苗中產(chǎn)生真菌主要是因為主體接觸不干凈的物質(zhì)，如灰塵而生長的，在此環(huán)境下，可以通過提升培養(yǎng)環(huán)境與操作環(huán)境方法減少真菌產(chǎn)生。另外植物組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源菌污染的處理工作比較復雜。該污染指外植體材料內(nèi)部中微生物，此處不能使用一般表面消毒方法清除，主要解決步驟為：①升級外植體的消毒方法，如間隙消毒;②使用前仔細檢查培養(yǎng)物質(zhì)量，閱讀藥品合格證與使用方法，因為有些污染需在很長時間之后才表現(xiàn)出來，甚至有些污染很難被發(fā)現(xiàn)，切記不能使用質(zhì)量低或者過期藥品做培養(yǎng)基;③適當使用抗生素。

2、組培苗玻璃化

植物組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常遇見半透明狀的畸形試管苗，對這類植物體叫做“玻璃苗”，此類現(xiàn)象叫做“玻璃化現(xiàn)象”，又稱過度水化現(xiàn)象。組織苗一旦發(fā)生玻璃化，其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生理功能產(chǎn)生異常，主要體現(xiàn)為分化能力下降，不能獨立增殖成芽或者生根，移栽到自然界中更是很難成活。因此要采取防治手段，主要有下面幾點：①使用固體培養(yǎng)方法，提升瓊脂濃度，減少培養(yǎng)基中襯質(zhì)勢。通過此方法可減少玻璃化概率;②適當提升培養(yǎng)基中蔗糖比例，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，減少植物材料吸收水分量，不會產(chǎn)生水分脅迫;③注意培養(yǎng)基的通氣，如用棉塞，降低培養(yǎng)容器中空氣濕度，優(yōu)化氧氣供應;④減少培養(yǎng)基中細胞分裂素和赤霉素的濃度;⑤采取低溫處理手段。⑥增加自然光照;⑦增加培養(yǎng)基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低氮氯比例，此處需注意降低銨態(tài)氮濃度，但是盡量提升硝態(tài)氮含量。

（作者單位：123000遼寧省阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新推廣中心（市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院））