甲氧蟲酰肼對蠶體谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響

呂艷艷 吳朋飛 王 飛 嚴(yán)會(huì)超 徐 成 王葉元※

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蠶絲科學(xué)系 廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院 廣東廣州 510642）

1 前言

家蠶是一種以桑葉為主飼料且能吐絲結(jié)繭的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，家蠶與其它昆蟲相比對農(nóng)藥更為敏感，蠶體直接接觸或食下被農(nóng)藥嚴(yán)重污染的桑葉時(shí)都會(huì)引起家蠶急性中毒或慢性中毒，因此它是一種我國農(nóng)藥登記中環(huán)境生態(tài)的非靶標(biāo)生物，也是廣泛用于科學(xué)研究的模式昆蟲之一[1]。

蠶品種、農(nóng)藥類別和發(fā)育階段等多種因素都會(huì)影響到農(nóng)藥對家蠶的毒性。一般情況下，除蟻蠶外，二齡蠶對農(nóng)藥最為敏感，對其他齡期來說，齡期越大越不敏感。但是五齡期比較特殊，五齡中后期蠶會(huì)對農(nóng)藥比低齡期更為敏感，即使添食微量的農(nóng)藥也會(huì)導(dǎo)致家蠶結(jié)畸形繭或不結(jié)繭，使羽化后的雌蛾產(chǎn)卵量降低或不產(chǎn)卵。除此之外，也不是所有的農(nóng)藥對家蠶都表現(xiàn)為急性致死效應(yīng)，因此在評(píng)價(jià)作用機(jī)制比較特殊的殺蟲劑（例如甲氧蟲酰肼）對家蠶的毒性時(shí)，還應(yīng)對它的生長發(fā)育及生理變化等情況做進(jìn)一步觀察和研究[1～2]。

1.1 甲氧蟲酰肼簡介

農(nóng)藥種類繁多，依據(jù)用途不同可將其分為：殺蟲劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺軟體動(dòng)物劑、殺鼠劑、殺線蟲劑、除草劑等七個(gè)大類。

甲氧蟲酰肼是一種新型的殺蟲劑類型的農(nóng)藥，主要適用于殺害鱗翅目害蟲，在昆蟲發(fā)生自然蛻皮之前的任何時(shí)間它都可以對昆蟲產(chǎn)生抑制蛻皮作用[3]。其原理是它的結(jié)構(gòu)與鱗翅目昆蟲分泌的蛻皮激素相似，會(huì)導(dǎo)致鱗翅目類昆蟲提前發(fā)生蛻皮反應(yīng)，但是由于體內(nèi)的某些物質(zhì)不足而不能形成新表皮，最后昆蟲會(huì)脫水或者饑餓而最終死亡。甲氧蟲酰肼以觸殺作用為主，也有少量的內(nèi)吸作用。目前甲氧蟲酰肼已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蔬菜、小麥、果樹、棉花等農(nóng)作物的田間鱗翅目害蟲（如甜菜夜蛾）的防治。因此，它成為桑園相鄰的農(nóng)田害蟲防治中比較常用的農(nóng)藥之一。

國內(nèi)外對甲氧蟲酰肼的研究較多，主要是研究甲氧蟲酰肼對鱗翅目類害蟲的毒性。研究表明甲氧蟲酰肼對棉鈴蟲、玉米螟、甘薯麥蛾、甜菜夜蛾、薊馬、斜紋夜蛾、大螟、美國白蛾、楊小舟蛾、茶尺蠖、黃夜螟、菜青蟲等多種鱗翅目害蟲都有毒害作用，其中有些是關(guān)于甲氧蟲酰肼對上述某種鱗翅目害蟲的毒性、安全性評(píng)估、生理生化影響的研究[4～5]。

但關(guān)于甲氧蟲酰肼對家蠶的研究文獻(xiàn)較少，有關(guān)于甲氧蟲酰肼對家蠶的發(fā)育、變態(tài)和主要蛋白合成的影響[6]，及阿維菌素和甲氧蟲酰肼兩種農(nóng)藥分別對家蠶的毒性及混合后對家蠶的毒性，并根據(jù)毒性測定結(jié)果進(jìn)行了安全評(píng)估[7]。

1.2 谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶概況

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，簡寫GPT）與蠶體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。

丙氨酸是蠶絲的主要合成原料，故丙氨酸的生成量能夠在很大程度上影響蠶絲的生成量。而丙氨酸的合成有兩條主要途徑：I. 桑葉里的大量天門冬氨酸可以通過谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用及草酰乙酸的脫酸作用生成丙氨酸；II. 在輔酶Ⅰ的遞氫作用下，乳酸脫氫酶與谷氨酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，并在谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成丙氨酸。在這兩條途徑中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶都發(fā)揮了重要的作用，因此谷丙轉(zhuǎn)氨酶可以作為預(yù)測蠶桑經(jīng)濟(jì)性狀的重要指標(biāo)之一。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，簡寫GOT）也是蠶體內(nèi)一種比較重要的酶，它大量存在于家蠶后部絲腺，跟谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用一樣，可以把谷氨酸轉(zhuǎn)化為絲素蛋白的主要氨基酸之一——甘氨酸。谷草轉(zhuǎn)氨酶也可以作為桑蠶經(jīng)濟(jì)性狀的重要生化指標(biāo)。

一些研究結(jié)果表明家蠶后部絲腺的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性與家蠶的繭質(zhì)相關(guān)，五齡第三天呈顯著正相關(guān)，第五天則相關(guān)不顯著，第七天卻變?yōu)闃O顯著負(fù)相關(guān)。因此這兩種酶可作為預(yù)測家蠶產(chǎn)絲量的重要生化指標(biāo)[9]。

關(guān)于蠶體不同部位谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的研究，劉限[10]測定了春柞蠶不同品種的中部、后部絲腺的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，研究結(jié)果表明谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量是影響蠶絲質(zhì)量的重要指標(biāo)。關(guān)于蠶體內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶的研究則特別少，關(guān)于谷草轉(zhuǎn)氨酶的研究大部分都是關(guān)于人體肝臟的。研究農(nóng)藥對動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量的影響[11～13]，主要研究對象有魚類、哺乳動(dòng)物類等。張彬彬[11]研究了農(nóng)藥乙草胺對泥鰍肝臟內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性的影響，主要通過不同濃度的乙草胺溶液浸泡泥鰍不同的時(shí)間后，測定泥鰍肝臟內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶來研究該農(nóng)藥對泥鰍生理生化的影響，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用乙草胺處理泥鰍一定時(shí)間可誘導(dǎo)其組織內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性提高，除此之外乙草胺濃度和暴露時(shí)間與泥鰍的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性變化存在一定的劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

1.3 研究意義及目的

家蠶是一種鱗翅目昆蟲，它是以桑葉為主飼料的寡食性昆蟲，其生長發(fā)育容易受到環(huán)境、飼料、病原微生物等因素影響，特別是桑園種植規(guī)模零星、分散，或與其它農(nóng)作物混種，由于農(nóng)藥使用不規(guī)范，環(huán)境污染越來越嚴(yán)重，養(yǎng)蠶安全逐漸受到關(guān)注。本文研究添食不同濃度的甲氧蟲酰肼對家蠶體內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響，為家蠶的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和制定家蠶安全健康養(yǎng)殖措施提供數(shù)據(jù)參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 藥品和試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（南京建成生物研究所），谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（南京建成生物研究所），無水乙醇，85 %磷酸溶液，生理鹽水，考馬斯亮藍(lán) G-250 ，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，99.1 %甲氧蟲酰肼原藥（由上海市農(nóng)藥研究所有限公司生產(chǎn)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所供應(yīng)）。

2.1.2 儀器設(shè)備

玻璃十字柄勻漿器，離心機(jī)，天平，制冰機(jī)，冰箱，離心管，移液槍，量筒，燒杯，水浴鍋，紫外分光光度儀，容量瓶，錐形瓶，試管，比色皿，試管架，烘箱，玻璃棒。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9·芙蠶品種，由廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心提供。

2.2 方法

2.2.1 甲氧蟲酰肼添食方法

將桑葉完全浸泡在不同濃度的甲氧蟲酰肼溶液 10 s后，晾干，給家蠶添食。

2.2.1.1 二、三齡蠶添食方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，96 h LC50為 0.144 mg a.i./L及GB/T31270.11 -2014 化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第 11部分：家蠶急性毒性試驗(yàn)、中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——化學(xué)農(nóng)藥 家蠶慢性毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則（征求意見稿）。將二、三齡蠶分為9個(gè)組，一個(gè)空白對照組，一個(gè)溶劑對照組和 7個(gè)不同濃度的甲氧蟲酰肼添食組，組距為 1.5，每組 3個(gè)平行，每個(gè)平行 25 頭蠶，同時(shí)在相同條件下養(yǎng)第四個(gè)平行30 頭蠶以備用。每組的編號(hào)及添食操作情況如表1。

其中受試物濃度的配置方法是：①稱取 0.01261 g受試物，用 0.4 mL N,N-二甲基甲酰胺和 0.025 g吐溫 80 溶解后，加入適量去離子水，轉(zhuǎn)移進(jìn)50 mL容量瓶中，定容得到濃度為250 mg a.i./L的受試物溶液。②將該濃度的受試物濃度用去離子水稀釋到所需濃度。③溶劑對照組配制方法主要為先量取0.4mL N,N-二甲基甲酰胺和0.025 g吐溫80 加入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至標(biāo)線，得到溶劑對照組貯備液1。從中取0.5 mL于50 mL容量瓶中，用去離子水定容至標(biāo)線，得到溶劑對照組貯備液 2。④從溶劑對照組貯備液2中量取6.40 mL于200 mL容量瓶，配制成溶劑對照組溶液。

表1 浸葉法—試驗(yàn)分組及濃度設(shè)計(jì)

空白組的桑葉不用浸泡。試驗(yàn)組和溶劑對照組在二齡起至三齡末期間添食不同濃度處理的桑葉，四至五齡添食正常桑葉。五齡第八天取樣蠶，-80 ℃的冰箱中保存以備使用。

2.2.1.2 五齡蠶添食方法

五齡家蠶采用同樣的分組方法，組距為1.8，受試物的配置方法與 2.2.1.1相同，但是受試物濃度分別為 1.63 ×10-4mg.a.i./L，2.94 ×10-4mg.a.i./L，5.29 ×10-4mg.a.i./L，9.53×10-4mg.a.i./L，1.71 ×10-3mg.a.i./L，3.09 ×10-3mg.a.i./L，5.56 ×10-3mg.a.i./L。從五齡起開始喂食，在五齡第八天取樣。

2.2.2 組織液獲取方法

在五齡第八天，每組的每個(gè)平行中隨機(jī)取1頭蠶，每組共3頭蠶，在-80 ℃存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)前取出蠶稱重，再與其體重9倍的生理鹽水混合后用玻璃十字柄勻漿器在冰水環(huán)境下研磨混勻后倒入離心管離心，2500 r/min離心10 min后，取上清液2 mL保存于離心管中做標(biāo)記，并將這些標(biāo)記好的上清液存于-40 ℃的冰箱中保存以待測量。剩余的上清液取出放入一個(gè)離心管內(nèi)標(biāo)記好保存在-40 ℃冰箱中另放好以備用。

2.2.3 測定蛋白質(zhì)濃度的方法

主要采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定[14]。

2.2.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定

按試劑盒要求操作。

2.2.5 谷草轉(zhuǎn)氨酶的測定

按試劑盒要求操作。

2.2.6 數(shù)據(jù)分析處理

本次數(shù)據(jù)分析使用的軟件主要是 Microsoft Office家庭版和學(xué)生版2016 的Exce1和SPSS.24.0。Excel用來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量。SPSS軟件主要通過單因素方差分析比較來對添食不同濃度甲氧蟲酰肼的最終酶含量與對照組進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05）。如果差異性達(dá)到顯著關(guān)系再用Duncan’s多重比較分析。數(shù)據(jù)分析的結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差a，b…”呈現(xiàn)。寫字母代表Duncan’s多重分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 蛋白質(zhì)測定結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

蛋白質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果如表 2。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到的回歸方程為y=0.0006 x-0.0213 ，用該公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，見表3。

表2 蛋白質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

圖1 測定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 蛋白質(zhì)濃度結(jié)果

表3 蛋白質(zhì)濃度結(jié)果

3.2 酶含量的測定結(jié)果

3.2.1 二三齡期添食酶含量

表4 二、三齡添食酶含量測定結(jié)果

從表 4可以看出，二、三齡蠶谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，除了T3和 T7兩組之外，其它試驗(yàn)組與對照組間都有顯著性增加。谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，除了 T3和 T7兩組，其它試驗(yàn)組與對照組之間有顯著性增加。

3.2.2 五齡期添食酶含量

表5 五齡添食酶含量測定結(jié)果

五齡添食酶含量測定結(jié)果見表 5，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性除了T4、T6和T7試驗(yàn)組的結(jié)果顯著低于空白對照組外，其他試驗(yàn)組與空白對照組都沒有顯著差異，且所有試驗(yàn)組都與溶劑對照組沒有顯著差異。谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，試驗(yàn)組 T2、T3、T5、T6與空白對照組之間有顯著增加；而與溶劑對照組相比，則只有T3和T5兩組有顯著差異。

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

4.1.1 不同齡期對農(nóng)藥敏感性不一樣

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，二、三齡蠶添食甲氧蟲酰肼，除了濃度為 2.27 ×10-3mg.a.i./L，1.40 ×10-2mg.a.i./L，其他添食濃度谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量有顯著增加。而五齡添食甲氧蟲酰肼，則大部分濃度都不會(huì)導(dǎo)致兩種酶的含量顯著增加，該結(jié)果與來有鵬[1]認(rèn)為家蠶不同齡期對農(nóng)藥的敏感程度是不一樣的結(jié)論相符。

4.1.2 家蠶生理變化與繭質(zhì)調(diào)查結(jié)果

課題組后續(xù)調(diào)查了添食上述不同濃度的甲氧蟲酰肼對家蠶繭質(zhì)的影響，結(jié)果表明二、三齡添食的蠶，試驗(yàn)組全繭量、繭層量、繭層率和蛹重都相對對照組隨濃度的增加而降低，但經(jīng)生物統(tǒng)計(jì)分析它們之間均無顯著差異。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測可能是二、三齡添食甲氧蟲酰肼后，導(dǎo)致蠶體內(nèi)蛋白代謝紊亂，故蠶體組織內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性總體上有所增加，此時(shí)蠶體吸收的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于生長發(fā)育，并不是用于合成絲物質(zhì)和造卵，故對蠶體后部絲腺的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量并沒有顯著的變化，因此對繭質(zhì)影響不大。

五齡蠶添食，試驗(yàn)組全繭量、繭層量、繭層率和蛹重都相對對照組有顯著降低，并呈現(xiàn)出隨濃度的增加而降低的規(guī)律。五齡一直添食甲氧蟲酰肼，導(dǎo)致蠶體組織蛋白代謝紊亂，五齡期蠶消化吸收的營養(yǎng)主要用于絲物質(zhì)合成，我們測定的是第八天的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量，有些濃度有差異、有些沒差異，可能我們測的是蠶體，而不能完全反應(yīng)絲腺組織的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶，彭衛(wèi)平[9]研究結(jié)果認(rèn)為家蠶后部絲腺的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性與家蠶的繭質(zhì)相關(guān)，五齡第三天呈顯著正相關(guān)，第五天則相關(guān)不顯著，第七天為卻變?yōu)闃O顯著負(fù)相關(guān)。可能不同濃度的酶活性與家蠶繭質(zhì)也存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

4.1.3 建議

本實(shí)驗(yàn)只研究了不同齡期和不同濃度的甲氧蟲酰肼對蠶的影響。甲氧蟲酰肼對蠶的毒性影響不僅受到齡期，藥物濃度等因素的影響，它還可能受到蠶品種，添食方法等多種因素影響。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明即使是微量的甲氧蟲酰肼也會(huì)對家蠶的生理造成一定的影響，并會(huì)對繭質(zhì)造成影響。因此，建議桑園一定要建立在遠(yuǎn)離可能會(huì)使用甲氧蟲酰肼等農(nóng)藥的農(nóng)田，除此之外，也要十分注意桑園用水是否會(huì)受到甲氧蟲酰肼污染。

4.2 小結(jié)

不同齡期蠶食下不同濃度甲氧蟲酰肼的桑葉，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的變化規(guī)律不同。二、三齡蠶添食，除了個(gè)別濃度，大部分濃度蠶體內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶都有顯著增加。而五齡蠶只有個(gè)別濃度蠶體的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶有顯著差異。