基于間充質(zhì)干細(xì)胞的抗菌治療及展望

朱冬振 李美蓉 姜玉峰 付小兵

（1.解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)所創(chuàng)傷愈合和細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室，北京 100853；2.戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心創(chuàng)面治療中心，北京 100101）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種自我更新的多能細(xì)胞，具有巨大的再生醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用潛能。MSCs分布于骨髓及其他器官間質(zhì)內(nèi)，包括脂肪組織，牙髓，產(chǎn)后組織如臍帶、胎盤或經(jīng)血[1-5]。間充質(zhì)和組織干細(xì)胞委員會(huì)和國(guó)際細(xì)胞療法學(xué)會(huì)（ISCT）對(duì)人MSCs定義的最低標(biāo)準(zhǔn)是：①黏附性；②表達(dá)特異性表面抗原，如表達(dá)CD105、CD73和CD90，不表達(dá)CD45、CD34、CD14或CD11b（均不表達(dá)或只表達(dá)其中之一）、CD79a或CD19（均不表達(dá)或吸表達(dá)其中之一）以及人類白細(xì)胞抗原-DR；③體外培養(yǎng)條件下，具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的多向分化潛能[6]。MSCs還具有損傷組織的趨化性及低免疫原性，使其成為細(xì)胞治療的有力工具[5]。目前，在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）臨床試驗(yàn)網(wǎng)站ClinicalTrails.gov(https://www.clinicaltrials.gov/)上注冊(cè)的基于MSCs的臨床試驗(yàn)超過(guò)500項(xiàng)。

雖然，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明了MSCs的生物效應(yīng)和再生特性，但是其具體機(jī)制仍然未知。目前普遍認(rèn)為MSCs發(fā)揮作用的機(jī)制之一是通過(guò)旁分泌作用，比如通過(guò)釋放生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子等活性物質(zhì)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[7]。研究顯示，MSCs具有很強(qiáng)的抗菌效應(yīng)[8-17]，包括間接抗菌作用和直接抗菌作用。其中間接抗菌作用主要是通過(guò)調(diào)節(jié)宿主對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，尤其是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)促炎和抗炎效應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡[18]，以及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的活性來(lái)完成[10,13,16]；而直接抗菌作用主要是通過(guò)分泌抗菌肽（AMPs）[11-12,14,17]，以及表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）[8]和IL-17[19]來(lái)完成。同時(shí)，MSCs已經(jīng)被證實(shí)在膿毒癥[9-12,14,16]、急性呼吸窘迫綜合征[13,17]和囊性纖維壞死感染[14]的前臨床模型中，都具有很強(qiáng)的細(xì)菌清除能力。為此，我們將目前關(guān)于MSCs的直接抗菌作用，尤其是MSCs源性的AMPs作用的研究進(jìn)展綜述如下，闡述能夠調(diào)節(jié)這些AMPs表達(dá)和分泌并且增強(qiáng)其抗菌效應(yīng)的機(jī)制。

1 AMPs的抗菌機(jī)制

AMPs是進(jìn)化保守的基因編碼小效應(yīng)分子，部分AMPs是機(jī)體構(gòu)成性存在的，而另一部分則可能是由于感染或炎癥誘發(fā)而產(chǎn)生。AMPs具有廣泛的抗菌作用和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，可以選擇性地對(duì)抗細(xì)菌、酵母菌、真菌、病毒，甚至是癌細(xì)胞[20]。AMPs通過(guò)不同的作用機(jī)制發(fā)揮清除微生物的作用，同時(shí)一些AMPs也受pH、AMPs自身濃度和鹽濃度等多種因素的影響[20-21]。人類AMPs主要通過(guò)與細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的不同分子靶點(diǎn)相互作用來(lái)發(fā)揮效應(yīng)。AMPs介導(dǎo)的殺菌機(jī)制通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性，抑制蛋白質(zhì)DNA和RNA的合成，以及和某些細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)相互作用來(lái)發(fā)揮抗菌作用[20]。AMPs通常只對(duì)一類抗原發(fā)揮作用，比如細(xì)菌或真菌，也有一些AMPs可同時(shí)對(duì)幾種微生物發(fā)揮作用[22]，還有一些特殊的AMPs可作用于對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥的多重耐藥菌，對(duì)其發(fā)揮殺傷作用。盡管在臨床使用和商業(yè)化過(guò)程中，AMPs仍然有很多問題需要解決，如給藥途徑、潛在的毒性、穩(wěn)定性和較高的生產(chǎn)成本，但這些問題也無(wú)法阻止AMPs成為藥物開發(fā)的熱點(diǎn)[23]。AMPs除了具有直接殺菌作用外，其間接生物學(xué)效應(yīng)也有助于控制感染[24]。上皮細(xì)胞分泌的AMPs具有多種生物學(xué)特性，包括細(xì)胞因子和抗內(nèi)毒素活性、抑制蛋白酶、細(xì)菌調(diào)理和促血管生成特性[24]。

目前研究表明，MSCs主要表達(dá)4種AMPs：LL-37[11,14]、人β-防御素-2(hBD-2)、鐵調(diào)素(hepcidin)[12]和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(Lcn2)[17]，并且在感染及炎癥狀態(tài)下，這些AMPs可被進(jìn)一步調(diào)節(jié)，以增強(qiáng)細(xì)菌清除率。MSCs發(fā)揮抗菌作用可能部分與這4種類型的AMPs有關(guān)。其中，LL-37對(duì)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞具有趨化性[25]。LL-37也被證明具有中和脂多糖（LPS）的效應(yīng)，在膿毒癥小鼠模型中顯示出抗感染性休克的作用[26]。β-防御素也有類似LL-37的作用，這可能由CC趨化因子受體6（CCR6）途徑介導(dǎo)[27]。而鐵調(diào)素和Lcn2[17]主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的鐵的利用來(lái)發(fā)揮作用[17,28]。

2 MSCs抗菌效應(yīng)的體外研究

MSCs抗菌特性的研究大多數(shù)來(lái)自于體外實(shí)驗(yàn)，且很少有關(guān)于MSCs對(duì)病毒、真菌和寄生蟲作用的研究[29]。由AMPs介導(dǎo)的不同來(lái)源MSCs的抗菌效應(yīng)、作用機(jī)制和抗菌范圍已有所研究。MSCs可以針對(duì)特定類型抗原產(chǎn)生最有效AMPs的特異性應(yīng)答，且小鼠和人MSCs的抗菌作用機(jī)制存在種屬差異性。不同來(lái)源的MSCs中檢測(cè)到和未檢測(cè)到的AMP類型見表1。

表1 不同MSCs來(lái)源的AMP類型

目前，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合已得到大量實(shí)驗(yàn)的證明[30-31]，其抗菌特性的研究也最為廣泛。人類BMSCs的抗菌效果是由LL-37[11,14]和鐵調(diào)素[12]介導(dǎo)的。在受到刺激和未受到刺激的BMSCs中均能檢測(cè)到AMPs。Krasnodembskaya等[10]的研究表明，BMSCs本身或其條件培養(yǎng)基均能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但前提是BMSCs必須經(jīng)過(guò)細(xì)菌預(yù)處理。另外，人防御素-2（hBD-2）、hBD-3、Lcn2和表面蛋白D(SPD)在BMSCs中不表達(dá)或者含量極低，不具備抗菌效果。近來(lái)，Sutton等[14]的研究表明，BMSCs主要分泌LL-37，在體外發(fā)揮很強(qiáng)的抗銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌作用，并控制細(xì)菌生長(zhǎng)速率和轉(zhuǎn)化成集落形成單位。這些數(shù)據(jù)表明，AMPs可能成為傳統(tǒng)抗生素有效的輔助藥物。并且，在受到炎癥刺激如采用γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1 β（IL-1 β）或IL-12預(yù)處理后，BMSCs分泌LL-37的水平升高[11-12]。相關(guān)的研究顯示，受到刺激和未受到刺激的BMSCs均未檢測(cè)到hBD-2和hBD-3的表達(dá)[14]。值得注意的是，BMSCs只有在胎牛血清培養(yǎng)基環(huán)境中才能檢測(cè)到LL-37，而在無(wú)血清和血小板裂解產(chǎn)物培養(yǎng)條件下，BMSCs的抗菌效能和產(chǎn)生LL-37能力下降[14]。BMSCs發(fā)揮抗菌特性不僅局限在AMPs的活性方面，實(shí)際上，經(jīng)過(guò)炎癥因子刺激，BMSCs中IDO表達(dá)大量增加，并能夠針對(duì)臨床相關(guān)細(xì)菌、寄生蟲和病毒發(fā)揮自主廣譜的抗菌效果[8]。此外，研究顯示，IL-17陽(yáng)性小鼠BMSCs具有較強(qiáng)的抗真菌活性[19]。IL-17對(duì)白色念珠菌的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性，而抗IL-17抗體能部分降低小鼠BMSCs抗白色念珠菌的能力[19]。小鼠BMSCs具有對(duì)大腸桿菌和白色念珠菌的抗菌效應(yīng)潛能，但和人類BMSCs相比，其發(fā)揮抗菌效應(yīng)的作用機(jī)制不同。Balan等[32]的研究結(jié)果顯示，大腸桿菌預(yù)處理的小鼠BMSCs， Lcn2的產(chǎn)生顯著增加，但并未檢測(cè)到LL-37的分泌[17]。此外，與人的BMSCs相比，小鼠BMSCs即使在炎癥因子如IFN-γ、IL-1β或IL-12的刺激下，也不能表達(dá)IDO，因此它們對(duì)細(xì)菌沒有抑制作用[8]。但是也有報(bào)道顯示，未受到刺激的小鼠BMSCs對(duì)大腸桿菌或金黃色葡萄球菌有直接的吞噬作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性[16]，這一說(shuō)法仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于經(jīng)血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MenSCs）可采用非侵入方式收集，并具有能夠保證細(xì)胞數(shù)量及相同的遺傳背景等優(yōu)點(diǎn)，有望成為細(xì)胞治療的另一種具有吸引力的細(xì)胞源[2]。MenSCs能夠通過(guò)分泌鐵調(diào)素發(fā)揮重要的抗菌作用。多種細(xì)菌均能夠增加MenSCs中鐵調(diào)素的表達(dá)，而其他AMPs，如LL-37和hBD-1-2-3仍然低于檢測(cè)限[12]。在缺氧條件，鐵調(diào)素下調(diào)會(huì)導(dǎo)致MenSCs的抗菌性能喪失，也表明了其鐵調(diào)素依賴的抗菌機(jī)制[12]。從這個(gè)角度來(lái)看，缺氧對(duì)MenSEs功能的影響可以被認(rèn)為是其抗菌活性的負(fù)調(diào)節(jié)劑，但缺氧本身又可以增強(qiáng)MenSEs的促血管生成作用[2]。因此，培養(yǎng)條件對(duì)于MenSCs的生物學(xué)效應(yīng)非常重要。然而，缺氧對(duì)于MSCs的調(diào)節(jié)作用在很大程度上取決于MSCs的來(lái)源，比如有研究表明，低氧條件下，并不改變AT-MSCs的免疫抑制能力[33]。

Sung等[34]的研究顯示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）或細(xì)菌預(yù)處理后的UC-MSC來(lái)源條件培養(yǎng)基均能夠顯著抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)?；虮磉_(dá)譜分析顯示，大腸桿菌刺激后，UC-MSCs中Toll樣受體-2（TLR-2）和TLR-4以及hBD-2顯著上調(diào)，提示MSCs可能通過(guò)TLR信號(hào)通路分泌hBD-2來(lái)發(fā)揮抗菌作用。特異性拮抗或沉默TLR-4后，反應(yīng)性的hBD-2增高消失，MSCs的體外抗菌作用降低。額外補(bǔ)充hBD-2可恢復(fù)MSCs的體外抗菌作用，進(jìn)一步提示MSCs的抗菌效果僅通過(guò)TLR-4途徑分泌hBD-2介導(dǎo)。在該研究中，其他AMPs（如LL-37或Lcn2）的水平并未顯著上調(diào)。

此外，AT-MSC或其條件培養(yǎng)基也顯示出抗微生物作用。Sutton等[14]報(bào)道，AT-MSCs的條件培養(yǎng)基將銅綠假單胞菌生長(zhǎng)速率降低的作用與遺傳霉素（一種廣譜氨基糖苷類抗生素）的作用相當(dāng)。重要的是，AT-MSC結(jié)合遺傳霉素顯示出對(duì)銅綠假單胞菌的有效抗菌作用，揭示了這種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞具有增強(qiáng)抗生素效能的作用。

3 MSCs抗菌效應(yīng)的體內(nèi)研究

MSCs在體外的抗菌能力在體內(nèi)也得到證實(shí)。不同來(lái)源MSCs能夠減輕不同臨床前模型中收集到的血液、脾臟、腹膜、肺和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中病原體的負(fù)載，并且與給藥途徑、劑量或注射時(shí)間無(wú)關(guān)[9-17]。

在大腸桿菌肺炎的免疫活性模型中，BMSCs處理后能夠明顯降低肺勻漿（LH）和BALF中的總細(xì)菌數(shù)量[11]。并且，BMSCs處理組中BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)也較低，表明BMSCs處理的小鼠不依賴于免疫細(xì)胞的募集來(lái)清除細(xì)菌。另外，中和LL-37抗體能夠拮抗BMSCs的體內(nèi)抗菌效果，這表明BMSCs的體內(nèi)抗菌活性需要依賴LL-37發(fā)揮作用[11]，這些結(jié)果與Sung等[34]的研究結(jié)果一致。Sung等[34]的研究顯示，同樣在大腸桿菌肺炎的免疫活性模型中，注射UC-MSCs會(huì)引起炎癥反應(yīng)下調(diào)和細(xì)菌清除率增加，增加BALF中的hBD-2分泌，并增強(qiáng)由此產(chǎn)生的對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的肺炎的保護(hù)作用。由于MSCs分泌的hBD-2是通過(guò)TLR-4途徑介導(dǎo)，因此UC-MSCs的抗菌效果可被TLR-4 siRNA轉(zhuǎn)染的UC-MSC所消除[34]。此外，另一類似臨床前模型研究證明，小鼠BMSCs移植后，BALF中抗菌分子Lcn2的濃度增加，并且使用單克隆抗體阻斷Lcn2會(huì)導(dǎo)致MSCs體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抗菌效果喪失[17]。

在盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)誘導(dǎo)產(chǎn)生的多微生物敗血癥的免疫活性小鼠模型中，人或小鼠來(lái)源MSCs的移植顯著減輕了病原體的負(fù)載，并顯著改善了小鼠存活率[9,12,16,35]。另外，穿刺誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，移植MenSCs后，能夠降低動(dòng)物死亡率，同時(shí)能夠改善器官功能障礙，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血液中的細(xì)菌清除，這與抗生素治療效果相當(dāng)[12]。并且，MenSCs與抗生素聯(lián)合能夠起到協(xié)同作用，進(jìn)一步提高生存率[12]。此外，Gonzalezrey等[9]研究顯示，AT-MSC處理的膿毒癥小鼠具有比未經(jīng)AT-MSC處理小鼠更低的腹膜細(xì)菌計(jì)數(shù)，表明AT-MSC可通過(guò)自身或通過(guò)活化其他細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗菌性。

囊性纖維化病是一種遺傳性疾病，其中肺部感染和炎癥是造成其發(fā)病和死亡的主要原因。在囊性纖維化病的小鼠模型中，感染銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌后，進(jìn)行BMSCs或其條件培養(yǎng)基移植，能夠明顯減少BALF中上述兩種病原體的細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。目前，尚未見LL-37的體內(nèi)抗菌效應(yīng)的報(bào)道，但是體外的數(shù)據(jù)都顯示它們具有在體內(nèi)抑菌的潛能[14]。

4 前景和挑戰(zhàn)

目前，除通過(guò)輸注MSCs或者直接給予合成或天然AMP方式提高機(jī)體的抗菌性外，一些研究還希望通過(guò)膳食營(yíng)養(yǎng)素和維生素調(diào)節(jié)體內(nèi)內(nèi)源性細(xì)胞的AMP表達(dá)，以促進(jìn)先天免疫反應(yīng)[36]。已有研究顯示，維生素D3可直接調(diào)節(jié)人抗微生物肽LL-37和hBD-2的表達(dá)[37-38]。最近的一項(xiàng)研究顯示，ICU中進(jìn)行機(jī)械通氣的患者中，使用高劑量維生素D3能夠縮短住院時(shí)間，但血漿LL-37濃度或其他臨床結(jié)局無(wú)明顯變化[39]。維生素D具有刺激MSCs成骨的潛能[40]。這就需要體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定維生素D對(duì)MSCs的生物學(xué)效應(yīng)。鑒于MSCs在機(jī)體中分布廣泛，所以，刺激內(nèi)源性MSCs中AMP分泌是提高機(jī)體自身抗菌效能的具有前景的策略。

隨著耐藥菌株的不斷增加，臨床迫切需要新的抗菌策略。發(fā)現(xiàn)新類別的抗菌藥物或AMP非常具有應(yīng)用前景，但這不是對(duì)抗耐藥菌株的唯一策略。事實(shí)上，提高AMP的輸送效率、生物利用度、體內(nèi)釋放和吸收，同時(shí)減少其清除和不良反應(yīng)，都可以成為擊敗耐藥菌株的助力器。而MSCs本身就可以顯著改善AMP的藥代動(dòng)力學(xué)。它通過(guò)感應(yīng)機(jī)體變化，發(fā)出釋放AMP的信號(hào)，并能夠趨化到損傷部位，在感染部位持續(xù)釋放AMP，并且釋放的AMP的種類與所受到的刺激相關(guān)。因此，專注于增強(qiáng)MSC的抗菌功能，可能更有利于其體內(nèi)的抗菌效能。

5 結(jié) 論

MSCs通過(guò)間接和直接機(jī)制發(fā)揮強(qiáng)烈的抗微生物作用，部分機(jī)制是通過(guò)分泌AMP來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在特定預(yù)處理后，可以進(jìn)一步增強(qiáng)其在包括膿毒癥[9-12,14,16]、急性呼吸窘迫綜合征[13,17]和囊性纖維壞死感染[14]中的抗菌效應(yīng)。這些證據(jù)都揭示了MSCs具有顯著的抗菌效應(yīng)，進(jìn)一步增加MSCs中AMP的表達(dá)和分泌以增強(qiáng)其抗菌效能，是現(xiàn)實(shí)可行的抗菌策略。在不同的前臨床模型中，MSCs預(yù)處理可提高M(jìn)SCs源性AMPs的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)菌清除能力[9-14,16]。目前已知的預(yù)處理方式包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和UVB光刺激。隨著研究的進(jìn)展，應(yīng)該會(huì)發(fā)現(xiàn)更為有效的預(yù)處理方式及更加有效的聯(lián)合抗菌方案。