豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對不同時間小鼠創(chuàng)面基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及蛋白激酶B表達(dá)的影響

胡映月 李恭馳 鄒利軍 馮自波 杜 燁 王 知 潘銀根 李炳輝

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)科，湖北 武漢 430077； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院手外科，湖北 武漢 430022； 3.江蘇省啟東市人民醫(yī)院整形美容科，江蘇 啟東 226200）

大面積創(chuàng)面及慢性難愈合創(chuàng)面的修復(fù)是醫(yī)學(xué)難點，給患者個人及社會都帶來沉重的醫(yī)藥負(fù)擔(dān)[1-2]。大面積創(chuàng)面和慢性難愈合創(chuàng)面引起的全層皮膚損傷常伴有表皮和真皮的缺失。創(chuàng)面愈合的傳統(tǒng)治療方法主要針對炎癥細(xì)胞，實際上創(chuàng)面治療的目的不僅是表皮層、真皮層再生，更關(guān)鍵的是皮膚功能的恢復(fù)[3]。臨床多用自體游離皮片移植治療大面積深度燒傷創(chuàng)面或嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚軟組織缺損，效果良好，但往往患者自身供皮量有限，并且還存在著瘢痕愈合及供皮區(qū)額外損傷的缺陷。有研究發(fā)現(xiàn)，使用自體游離皮片或真皮替代物治療創(chuàng)面，可明顯減輕瘢痕攣縮，如果結(jié)合培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞治療，效果會更加明顯[4-5]。我們團(tuán)隊在此前的實驗中發(fā)現(xiàn)，大面積的皮膚缺損在沒有皮膚移植和傷口未閉合的情況下，通過ADT（一種進(jìn)口牛肌腱組織工程材料）治療可以治愈，同時還有毛囊和汗腺再生的跡象[6]。由此我們猜想，國產(chǎn)類似的組織工程材料如豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（porcine acellular dermal matrix, pADM）可能也具有促進(jìn)毛發(fā)生長的作用。我們采用7 d的創(chuàng)面模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了與毛囊再生相關(guān)的因子如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1, SDF-1） 及Wnt3a等表達(dá)的差異[7]。部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SDF-1 / CXCR4途徑可以通過激活PI3K/AKT信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移[8-11]。為了進(jìn)一步研究pADM對全層皮膚缺損創(chuàng)面及皮膚附件（主要是毛囊）修復(fù)的機制，我們觀察了pADM作用不同時間后小鼠創(chuàng)面SDF-1及蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）的表達(dá)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級健康C57BL/6小鼠18只，雄性，4周齡，體質(zhì)量16～18 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK 2015-0001。飼養(yǎng)觀察1周后用于實驗。pADM由江蘇優(yōu)創(chuàng)生物醫(yī)學(xué)科技有限公司贈送。產(chǎn)品注冊證號：國械注準(zhǔn)20173463366。4%多聚甲醛、PBS溶液、10×EDTA修復(fù)液、蘇木素染液均購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，無水乙醇、二甲苯、過氧化氫、中性樹膠均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，牛血清白蛋白（BSA）購自瑞士Roche公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，一抗SDF-1購自英國Abcam公司，一抗AKT購自美國Cell Signaling Technology公司，二抗辣根過氧化物酶(HRP)購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。組化筆購自上海Genetech公司，普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、成像系統(tǒng)均購自日本OLYMPUS公司。

1.2 創(chuàng)面模型的建立 18只5周齡、體質(zhì)量約（23±2） g的C57BL/6雄性小鼠，用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑量按10 mg/kg計算。小鼠麻醉后背部剃毛，酒精消毒皮膚。以脊柱為中線，在左、右兩側(cè)各制作一個直徑為6 mm的圓形全切除傷口，均用直徑6 mm、高3 mm的柱狀硅膠支撐架間斷縫合于創(chuàng)面處，以隔離創(chuàng)面與臨近皮膚,防止周圍皮膚攣縮而影響創(chuàng)面愈合過程。硅膠支撐架的一端有一高1 mm、長2 mm缺口，缺口處形成創(chuàng)面窗，使得缺口成為連接創(chuàng)面與周圍完整皮膚的唯一途徑，用來觀察是否有新生上皮通過缺口遷移到創(chuàng)面。小鼠背部左側(cè)創(chuàng)面用生理鹽水浸濕的紗布覆蓋（對照組），將微粒狀pADM用生理鹽水調(diào)和成糊狀后覆蓋在右側(cè)創(chuàng)面上（pADM組），左右兩側(cè)再同時用彈力繃帶固定,觀察小鼠的狀態(tài)。模型建立后動物單籠喂養(yǎng)，自由攝食與飲水。

1.3 組織取材 分別于模型建立第1周、第2周、第3周、第4周、第6周、第8周，處死小鼠，每個時間點3只，每個創(chuàng)面取創(chuàng)緣組織（即未愈合創(chuàng)面組織與愈合的創(chuàng)面組織交界處）約150～200 mg，固定于4%多聚甲醛中，制作石蠟切片。

1.4 免疫組化檢測SDF-1和AKT蛋白表達(dá) 石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，用PBS洗3次，每次5 min。切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min低火至沸。自然冷卻后PBS洗3次，每次5 min。切片置于3%過氧化氫溶液中，室溫避光孵育10 min。PBS洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封閉20 min。去除BSA液，每張切片分別加入約50 μl稀釋的一抗SDF-1（1∶100）,AKT(1:300)覆蓋組織，4 ℃過夜。PBS洗3次，每次5 min。去除PBS液，每張切片加50～100 μl相應(yīng)種屬的二抗HRP(1∶200)，37 ℃孵育50 min。PBS洗3次，每次5 min。去除PBS液，每張切片加50～100 μl新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化（約1 s），自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片經(jīng)過梯度乙醇（75%、90%、100%、100%）10 min，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，利用圖像分析軟件測量圖片染色程度，以積分吸光度（A）值反映蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以 表示，SDF-1及AKT兩種因子在不同時間點多組間的比較采用重復(fù)測量方差分析（F檢驗），不同時間點兩種因子在pADM組及對照組兩組間的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面大體觀察 在模型建立1周后，pADM組、對照組創(chuàng)面均開始縮小，創(chuàng)面開口處出現(xiàn)肉眼可見的新生上皮組織，與我們前期的研究觀察到的結(jié)果相同[7]。pADM組隨著時間推移，創(chuàng)面逐漸縮小，至第3周時創(chuàng)面基本完全愈合。從第4周開始創(chuàng)面處開始出現(xiàn)零星白色毛發(fā)，之后逐漸豐富，至第8周時毛發(fā)基本覆蓋創(chuàng)面。而對照組愈合速度較慢。

2.2 SDF-1和AKT的蛋白表達(dá) 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，在模型建立后的第 1、2、3、4、6、8周各觀察時間段，SDF-1及AKT兩種因子的蛋白表達(dá)不同，SDF-1蛋白表達(dá)積分A值不同觀察時間之間的效應(yīng)差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.719，P=0.000），pADM組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=47.513，P=0.002）；AKT蛋白表達(dá)A值不同觀察時間之間的效應(yīng)差異也存在統(tǒng)計學(xué)意義（F=94.905，P=0.000），pADM組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.978，P=0.159）。pADM組及對照組兩組間的SDF-1蛋白表達(dá)不同，其中第3、8周時差異具有顯著性（t3=8.559，P=0.001；t8=-7.042，P=0.002），其他時間兩組間差異無顯著性。AKT蛋白表達(dá)則在第2、3、4、6、8周時兩組間差異具有顯著性（對應(yīng)t2=6.097，P=0.004；t3=8.462，P=0.001；t4=-9.711，P=0.001；t6=-8.296，P=0.001；t8=-6.079；P=0.004），第1周時兩組間差異無顯著性。AKT與SDF-1兩種因子在pADM組中具體有相似的變化趨勢，均于第2周開始升高，于第3周達(dá)高峰，此時兩種因子在pADM組和對照組中表達(dá)差距最大；從第3周開始下降，到第8周又出現(xiàn)回升。見表1和表2。

2.3 創(chuàng)緣組織SDF-1和AKT蛋白表達(dá)的病理學(xué)觀察 免疫組化結(jié)果顯示，SDF-1及AKT在創(chuàng)面組織中表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布在毛囊細(xì)胞周圍，且pADM組中SDF-1及AKT的表達(dá)明顯高于對照組。見圖1（封二）。

3 討 論

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為生物支架，起著再生框架的作用，用于支持宿主細(xì)胞整合和新的膠原沉積，在復(fù)雜傷口修復(fù)、腭裂修復(fù)等顱面手術(shù)、腹壁缺損修復(fù)、假體乳房重建和美容手術(shù)等外科組織重建手術(shù)中發(fā)揮重要作用，后逐漸應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)[12]。

表1 不同時間的創(chuàng)緣SDF-1蛋白表達(dá)積分吸光度的比較（，n=3，A值）

表1 不同時間的創(chuàng)緣SDF-1蛋白表達(dá)積分吸光度的比較（，n=3，A值）

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第6周 第8周pADM組 1 109.52±120.43 3 665.77±157.04 15 206.00±3002.73 1 353.66±268.95 634.27±121.22 1 033.37±195.27對照組 1 110.98±219.14 3 116.41±616.41 364.15±72.6000 1 682.81±301.68 679.15±135.18 4 477.70±824.31 t值 -0.010 1.496 8.559 -1.411 -0.428 -7.042 P值 0.992 0.209 0.001 0.231 0.691 0.002

表2 不同時間創(chuàng)緣AKT蛋白表達(dá)的比較（，n=3，A值）

表2 不同時間創(chuàng)緣AKT蛋白表達(dá)的比較（，n=3，A值）

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第6周 第8周pADM 組 4 022.22±652.421 160.12±225.603 422.17±675.91 324.15±64.67 27.26±4.490 553.51±110.17對照組 4 342.58±778.50 337.13±61.370 118.80±18.080 834.98±64.19 395.70±76.791 938.00±378.80 t值 -0.547 6.097 8.462 -9.711 -8.296 -6.079 P值 0.614 0.004 0.001 0.001 0.001 0.004

在創(chuàng)面愈合過程中，創(chuàng)面組織再生的微環(huán)境具有重要作用。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是將供體皮膚用特殊方法去細(xì)胞化，在真皮基質(zhì)中保留其結(jié)構(gòu)和生物活性物質(zhì)，可支持宿主細(xì)胞再生[13]。同時脫細(xì)胞真皮基質(zhì)可以提供防止污染的屏障，維持潮濕的傷口環(huán)境，有助于促進(jìn)血管和細(xì)胞再生[14-16]。pADM是一種豬來源的工程化皮膚組織，其所有細(xì)胞成分都已被去除，在國內(nèi)應(yīng)用于創(chuàng)面治療中[17]。研究顯示，pADM可以最大程度地保留創(chuàng)面殘留的真皮組織和上皮細(xì)胞，保護(hù)內(nèi)部組織，幫助加速上皮細(xì)胞和干細(xì)胞的再生，促進(jìn)肉芽組織的生長[18]。

SDF-1及其受體CXCR4在多種類型組織中參與調(diào)節(jié)與損傷修復(fù)相關(guān)的干細(xì)胞的遷移[19]。SDF-1被認(rèn)為是未成熟造血干細(xì)胞的強效化學(xué)誘導(dǎo)劑[20]。研究表明，SDF-1與CXCR4結(jié)合后，可通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)其生物學(xué)行為，如調(diào)控細(xì)胞趨化、增殖、凋亡、存活和分化等生物功能[21]。同時SDF-1/CXCR4軸在皮膚創(chuàng)傷愈合中起重要作用[22]。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，從第2周開始，創(chuàng)緣組織AKT蛋白表達(dá)變化與SDF-1蛋白表達(dá)具有相似變化趨勢，這可能給我們提供了一條思路，在創(chuàng)面愈合過程中的不同時間，SDF-1/CXCR4軸可能通過激活PI3K/AKT而誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞等的增殖或遷移來促進(jìn)創(chuàng)面全層皮膚的愈合甚至是皮膚附屬器如毛囊的再生。

本次研究中第3周時SDF-1和AKT兩種因子在pADM組達(dá)到上升高峰，從第3周開始下降，到第8周開始回升，這可能是應(yīng)用pADM逐漸改變了創(chuàng)面的微環(huán)境，包括SDF-1及AKT的表達(dá)變化，從而刺激某些干細(xì)胞從周圍的正常組織遷移到傷口附近，啟動再生。而對于 SDF-1在第3、8周時pADM組及對照組兩組間的蛋白表達(dá)具有顯著性差異，其他時間兩組間無顯著性差異；AKT在第2、3、4、6、8周時兩組間的蛋白表達(dá)具有顯著性差異，第1周時兩組間則無顯著性差異，以及兩種因子上升及下降的變化與創(chuàng)面愈合程度的具體關(guān)聯(lián)，考慮到樣本量不大，且目前pADM促進(jìn)創(chuàng)面愈合的確切機制尚不明確，暫無法肯定分析SDF-1及AKT不同時間點兩組間這種差異的具體原因和它們上升及下降的變化與創(chuàng)面愈合程度的關(guān)聯(lián)。后續(xù)我們將考慮擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究pADM促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機制，必要時改進(jìn)pADM這種材料。

既往研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及表皮干細(xì)胞是皮膚種子細(xì)胞的重要來源，可以作為創(chuàng)面治療的突破口，尤其是表皮干細(xì)胞，體外研究顯示其能更穩(wěn)定地向表皮細(xì)胞分化，起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用[23]。已發(fā)現(xiàn)SDF-1可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞的遷移和增殖，從而加速皮膚傷口愈合[24-25]。本研究中通過免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)，SDF-1及AKT在創(chuàng)面組織中表達(dá)，且陽性細(xì)胞主要分布在毛囊細(xì)胞周圍。由此我們猜測，在創(chuàng)面愈合過程中，SDF-1及AKT可能促進(jìn)創(chuàng)面全層皮膚的愈合甚至是皮膚附屬器如毛囊的再生，但其具體機制尚不明確。

總之， pADM可能通過促進(jìn)SDF-1/CXCR4信號通路及下游信號因子AKT的表達(dá)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合或者毛囊修復(fù)，其機制還有待進(jìn)一步研究。