計(jì)算機(jī)輔助一清片徑向展開薄層色譜定性與定量方法初探

田春杰, 陳明鑫, 王丹琦, 王宏玲, 關(guān)建環(huán), 張夢婷, 孫國祥

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016)

普通薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)由于流動(dòng)相的輸送方式和色譜系統(tǒng)的不均衡性,在分離能力、效率和重復(fù)性方面還存在一些不足。

徑向薄層色譜法(RTLC),是一種將樣品呈圓形或環(huán)狀點(diǎn)樣,然后將展開劑從中心向外沿徑向輸送的薄層色譜方法[1]。該法于1950年首次報(bào)道[2],常應(yīng)用于多肽、氨基酸和重金屬的分離[3-5]。由于斑點(diǎn)的形態(tài)和展開方向的特殊性,目前用于分離的報(bào)道較多,對RTLC定性和定量的報(bào)道較少。

當(dāng)前,普通TLC的定性方法主要有比移值(Rf)定性和相對比移值(Rr)定性法[6]。普通TLC定量的方法有目視比較法[7]、洗脫測定法[8-10]、斑點(diǎn)面積法[11]、薄層掃描法[12,13]和與其他技術(shù)的聯(lián)用方法[14-18]。其中薄層掃描法是目前使用最多的方法,也是較為可靠的技術(shù)手段之一。

薄層掃描法也稱薄層光密度法,一般采用透射法或反射法測定斑點(diǎn)對光的吸收強(qiáng)度[19]。這兩種方法測定的分別是斑點(diǎn)對照射光的吸收情況或反射情況。透射法對薄層厚度及透明度有一定的要求,但反射法對其要求不高,因此反射法較為常用。

圖像分析儀通常和計(jì)算機(jī)連接使用,依賴于計(jì)算機(jī)輔助圖像分析技術(shù),是將圖像信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號并使用計(jì)算機(jī)對其進(jìn)行處理的過程[20]。目前,計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像描述、特征提取和模式識別在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[21-24]。

一清片(YQTs)由黃連、大黃、黃芩3味藥組成,其功效為清熱瀉火解毒和化瘀涼血止血,臨床上用于火毒血熱所致的大便秘結(jié)、咽炎、扁桃體炎、牙齦炎等的治療[25-27]。在280 nm下,黃芩中的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素均顯暗綠色;在335 nm下,野黃芩苷顯暗綠色[28,29]。在254 nm下,黃連中的巴馬汀和藥根堿顯黃綠色;在365 nm下,藥根堿顯棕褐色,小檗堿和巴馬汀顯黃色熒光[30-32]。大黃在365 nm下出現(xiàn)5個(gè)熒光斑點(diǎn),均顯橘黃色,分別為蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚和大黃酸,通過氨蒸汽熏蒸會(huì)呈現(xiàn)橙色斑點(diǎn)[33,34]。由于酸堿度、時(shí)間、顯色劑等均能導(dǎo)致藥材中有效成分的熒光淬滅[35-37],所以實(shí)驗(yàn)需控制好酸堿度、時(shí)間長短以及避開能導(dǎo)致熒光淬滅的顯色劑。

本探究旨在通過薄層色譜光密度反射法結(jié)合自編程的計(jì)算機(jī)圖像識別技術(shù),輔助實(shí)現(xiàn)一清片徑向展開薄層色譜技術(shù)定性和定量方法的開發(fā)與應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與分析軟件

ZF-C型3用紫外分析儀(上?？岛坦怆妰x器有限公司);超聲波清洗機(jī)(廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司); ISO 9001電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

10批YQTs(遼寧康博士制藥有限公司);鹽酸小檗堿(BH)化學(xué)對照品(批號:0713-9605,供含量測定用)、鹽酸藥根堿(JH)化學(xué)對照品(批號:0733-9605,供含量測定用)和鹽酸巴馬汀(PH)化學(xué)對照品(批號:0732-9604,供鑒別用)(中國藥品生物制品檢定所)。硅膠板(型號:HSGF254, 3色分開,煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司);正丁醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);乙酸乙酯(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司),冰乙酸(分析純,天津恒興化學(xué)試劑股份有限公司),無水乙醇(分析純,天津大茂化學(xué)試劑股份有限公司)。

軟件:Matlab 9.7, Origin 8.5, Photoshop CS 5。

1.2 溶液配制與展開溶劑系統(tǒng)

YQTs提取物:取1片YQTs,研細(xì),取約0.3 g,精密稱定,加入10 mL 90% (體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇,超聲30 min,過濾,取濾液,即得。

稱取適量的BH、JH和PH對照品,分別用甲醇配制成0.16 g/L的溶液。

選用正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水(7∶1∶1∶1, v/v/v/v)作為溶劑系統(tǒng),分離文中的BH、JH、PH對照品和YQTs提取物。

圖 1 徑向展開(a)裝置和(b)展開方式示意圖[38]Fig. 1 Schematic diagram of (a) radial expansion device and (b) expansion mode[38]

1.3 徑向展開裝置

使用針頭、橡膠塞、玻璃管等自組裝簡單的RTLC裝置(見圖1a)。在展開過程中,在中心處安裝一個(gè)帶孔的蓋子,可以幫助減少環(huán)境因素的影響。具體的測試條件可以根據(jù)實(shí)際測試靈活變動(dòng)。圖1b是RTLC的示意圖。試驗(yàn)過程中,用環(huán)狀工具點(diǎn)出A處所指的環(huán)形斑點(diǎn),或者用毛細(xì)管點(diǎn)出徑向斑點(diǎn),用輸送工具從圓心O處向固定相上輸送展開劑,展開劑沿B處箭頭所示各個(gè)方向由中心向外展開,洗脫分離組分。

圖 2 徑向薄層色譜定性和定量方法流程圖Fig. 2 Flow chart of qualitative and quantitative methods for radial thin layer chromatography

1.4 計(jì)算機(jī)輔助一清片徑向展開薄層色譜定性與定量方法的建立

使用相機(jī)在紫外燈下采集數(shù)字圖像后,對圖像進(jìn)行了一系列處理,具體操作流程見圖2。采用Photoshop CS 5對圖片進(jìn)行方形裁剪(尺寸可調(diào),一般4 cm×4 cm),調(diào)整圖片分辨率(數(shù)值可調(diào),一般800 DPI)。將調(diào)整好的圖片導(dǎo)入到Origin 8.5中,將數(shù)字圖片轉(zhuǎn)換為數(shù)字矩陣,矩陣橫縱坐標(biāo)對應(yīng)的是原圖片每個(gè)像素點(diǎn)的位置,數(shù)值對應(yīng)原圖片上各個(gè)像素點(diǎn)的灰度值(范圍0～255)。將數(shù)字矩陣導(dǎo)入到Matlab 9.7中,進(jìn)行灰度值積分:以矩陣中心為原點(diǎn),以1個(gè)像素點(diǎn)長度為步長,設(shè)定偏移量為±0.5個(gè)像素點(diǎn),對在同一步長范圍的各個(gè)像素點(diǎn)的灰度值進(jìn)行積分處理(步長和灰度值可調(diào))。數(shù)據(jù)擬合:以半徑為橫坐標(biāo),各半徑對應(yīng)的灰度值積分為縱坐標(biāo),繪制擬合曲線,進(jìn)行預(yù)評價(jià),尋找溶劑前沿對應(yīng)的半徑值,并通過橫坐標(biāo)的縮放變換,將溶劑前沿?cái)?shù)值固定(數(shù)值可調(diào),設(shè)為1最佳,此時(shí)橫坐標(biāo)即為比移值),即可得到RTLC數(shù)字化圖譜,將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)出。數(shù)字化圖譜后續(xù)的峰積分及其他特征參數(shù)提取在Origin軟件上完成。

上述的RTLC數(shù)字化圖譜中各峰頂點(diǎn)的橫坐標(biāo)即代表各組分的比移值,可直接用于定性。各峰面積經(jīng)過定量方法學(xué)驗(yàn)證合格后,即可以用于一清片中組分的含量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

將YQTs提取物和BH、JH、PH對照品各點(diǎn)樣3 μL,按照1.2、1.3節(jié)中方法展開后,照1.4節(jié)中方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。可確定峰1為JH,比移值0.27；峰2為PH,比移值0.38；峰3為BH,比移值0.47；樣品中組分比移值與對照品中該成分差異在±0.04以內(nèi)(見圖3)。結(jié)果表明,方法的專屬性良好,可用于RTLC定性。

圖 3 數(shù)字化后的RTLC(a)數(shù)字圖像和(b)數(shù)字色譜圖Fig. 3 (a) Digital image and (b) digital chromatograms of RTLC after digitization Peaks: 1. jateorhizine (JH); 2. palmatine hydrochloride (PH); 3. berberine hydrochloride (BH).

2.2 定量方法及其驗(yàn)證

2.2.1精密度

同一份YQT樣品,連續(xù)點(diǎn)樣6次,每次3 μL,展開后數(shù)據(jù)處理,以BH斑點(diǎn)面積計(jì)算RSD。RSD值為5.47%,本方法精密度可滿足薄層色譜技術(shù)要求。

2.2.2回收率

配制7份樣品,其中6份加入160 μg/mL的BH對照品溶液,混合均勻后,作為加樣待測液。一份與純甲醇按1∶1(v/v)混合,作為陰性液。每份樣品分別點(diǎn)樣2次,每次3 μL,展開后數(shù)據(jù)處理,根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算BH的回收率范圍及其RSD。其回收率范圍為92.5%～102.9%, RSD為4.08%。表明該方法的準(zhǔn)確度符合薄層色譜技術(shù)要求,可用于RTLC定量。

表 1 RTLC法測定YQTs中BH的定性和定量結(jié)果Table 1 Qualitative and quantitative results of BH in YQTs determined by RTLC

Rf: retardation factor; ES: external standard.

2.3 對照品線性

分別精密吸取對照品溶液(160 mg/L) 2、4、6、8和10 μL進(jìn)行展開,記錄色譜圖。分別以BH對照品質(zhì)量(X, ng)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。BH的線性回歸方程為:Y=0.123 8X+14.204(相關(guān)系數(shù)r=0.944 6)。結(jié)果表明:BH在60.5～960 ng范圍內(nèi)時(shí),可以使用峰面積來對YQTs中的BH進(jìn)行含量測定。

2.4 樣品測定

10批YQTs樣品和外標(biāo)樣品(ES, 160 mg/L)分別點(diǎn)樣2次,每次3 μL,展開后數(shù)據(jù)處理,記錄色譜圖。計(jì)算比移值進(jìn)行定性,根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算YQTs中BH的含量,結(jié)果見表1。10批YQTs中,小檗堿的含量范圍在2.38～3.65 mg/片之間,質(zhì)量差異較小。

2.5 計(jì)算機(jī)輔助RTLC定性與定量方法討論

在計(jì)算機(jī)輔助RTLC定性與定量方法中,有一些技術(shù)要點(diǎn):(1)圖片裁剪為方形,只是為了矩陣計(jì)算方便,將一個(gè)完整的展開裁入即可,并沒有其他嚴(yán)格要求。對圖片進(jìn)行固定大小的裁剪并調(diào)整分辨率是為了校正不同拍攝角度和不同拍攝距離導(dǎo)致的誤差。(2)分辨率、步長設(shè)置可以決定最后數(shù)字化的精度,與檢測器的數(shù)字采集密度是對應(yīng)的。分辨率高,步長小,則數(shù)據(jù)采集密度大。數(shù)據(jù)采集密度理論上越大越好,這樣可以保證采集信息的完整性和豐富度。但是實(shí)際上不宜過高,因?yàn)椴杉^多的數(shù)據(jù)會(huì)給計(jì)算機(jī)的存儲(chǔ)和運(yùn)算帶來負(fù)擔(dān),降低運(yùn)算速度,同時(shí)可能增大噪聲。本研究中,設(shè)定的圖片大小為4 cm×4 cm,分辨率為800 DPI,整張圖片的數(shù)據(jù)量為1 260×1 260個(gè),使用的計(jì)算機(jī)為全新自組裝臺式機(jī)(CPU: Intel Core i5-8400 CPU@2.80GHz;主板:華碩PRIME Z370-P;內(nèi)存:威剛8.00 GB (2400 MHz);主硬盤:250 GB (西數(shù)WDC WDS250G2 B0A-00SM50))。在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)和運(yùn)行性能良好的情況下,運(yùn)算時(shí)間大約為2分鐘。一般筆記本基本無法運(yùn)行,強(qiáng)行運(yùn)行速度緩慢甚至導(dǎo)致電腦死機(jī)或藍(lán)屏。(3)矩陣中心要盡可能準(zhǔn),這樣才能盡量保證數(shù)字化的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。(4)坐標(biāo)變換時(shí),溶劑前沿的固定數(shù)值是可調(diào)的,但在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行同一批分析時(shí)應(yīng)保證所有圖像處理時(shí)設(shè)定的溶劑前沿是相同的。這樣可以避免因分辨率、步長設(shè)置、圖像采集時(shí)相機(jī)與板間距離不固定,以及圖片裁剪大小不一致等造成數(shù)據(jù)失真和處理困難,同時(shí)相當(dāng)于固定量綱,便于定性和定量計(jì)算。(5)不提前進(jìn)行降噪等處理,既簡化了運(yùn)算過程,也盡可能保證了數(shù)據(jù)的原始性。(6)因圖片采集、背景差異等造成的誤差全部可以通過合理的背景扣除消除,而不影響定性和定量的準(zhǔn)確性。(7)灰度值積分是指以矩陣中心為原點(diǎn),以半徑為橫坐標(biāo),對與原點(diǎn)距離相同的所有像素點(diǎn)的灰度值進(jìn)行積分,這個(gè)過程類似于收折扇,為下一步的徑向展開數(shù)字化圖譜的生成提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ);由于像素點(diǎn)是一個(gè)個(gè)點(diǎn),是非連續(xù)的數(shù)據(jù),而半徑是連續(xù)數(shù)據(jù),所以只能采用步長加偏移量的方式將在一定距離范圍內(nèi)的像素點(diǎn)全部納入其中,既不重復(fù)統(tǒng)計(jì)像素點(diǎn),又不遺漏有效數(shù)據(jù)點(diǎn)。例如,當(dāng)半徑是2.5時(shí),偏移量±0.5的意思是,將半徑距離在2.0～3.0內(nèi)的像素點(diǎn)灰度值最終統(tǒng)計(jì)為一個(gè)數(shù)值。偏移量設(shè)置要與步長匹配,保證各像素點(diǎn)數(shù)據(jù)既不會(huì)被重復(fù)采集,又不會(huì)被遺漏。(8)經(jīng)數(shù)字化處理后,徑向展開的斑點(diǎn)擴(kuò)散、展開不均勻等問題會(huì)在峰寬和分離度上有所體現(xiàn),噪點(diǎn)會(huì)被均化,其實(shí)相當(dāng)于自動(dòng)去噪。(9)本文在進(jìn)行圖片處理時(shí),沒有進(jìn)行由彩色圖片到灰色圖片的灰度轉(zhuǎn)換,每一個(gè)像素點(diǎn)都有像素坐標(biāo)和像素亮度這兩個(gè)基本組成要素。一般圖片的像素坐標(biāo)特征采用矩陣表示,彩色圖片的亮度值可以采用RGB色彩模式或灰度值表示,灰度圖像的亮度值則只能用灰度值進(jìn)行表示。彩色圖像的灰度值與RGB色彩模式之間存在轉(zhuǎn)換公式:Gray=0.30Red+0.59Green+0.11Blue。Gray指灰度值,Red、Green、Blue是RGB色彩模式中紅、綠、藍(lán)3個(gè)通道的顏色。本文進(jìn)行轉(zhuǎn)換的目的是簡化處理,方便積分。當(dāng)然也可以對Red、Green、Blue單獨(dú)進(jìn)行灰度值積分,結(jié)果是否會(huì)具有更好的特征性值得進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

本文所采用的方法用于RTLC定性可靠度較好,在RTLC定量方面尚有欠缺,這可能與實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件等有關(guān)。實(shí)驗(yàn)儀器簡陋,手動(dòng)操作誤差大,數(shù)據(jù)采集時(shí)環(huán)境干擾大,都對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了嚴(yán)重影響。在本探究中,RTLC技術(shù)有很強(qiáng)的分離效率和潛在的半制備價(jià)值,使用適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備有望發(fā)揮RTLC的技術(shù)優(yōu)勢。計(jì)算機(jī)圖像處理和自編程方法的結(jié)合,給了RTLC和其他一些分析相關(guān)的技術(shù)廣闊的發(fā)展前景。薄層色譜技術(shù)的發(fā)展很難、很慢,但是這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢也是無可替代的。相信在未來,在計(jì)算機(jī)技術(shù)的輔助下,薄層色譜技術(shù)會(huì)邁上一個(gè)新的臺階。