超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜法同時(shí)快速測定血漿和尿液中84種有毒植物成分

張秀堯, 蔡欣欣, 張曉藝, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

自然界中,一些植物含有天然有毒成分,這些有毒成分被食用后會(huì)引起植物性食物中毒。最近幾年,食品安全受到廣泛關(guān)注,人們崇尚追求“無污染”和“純天然”的食品,喜愛采食野生植物,導(dǎo)致誤食有毒植物的中毒事件呈上升趨勢(shì),如黃夾苷A為黃花夾竹桃中的主要有毒成分,在斯里蘭卡常引起中毒[1,2],在我國烏頭生物堿類引起的中毒也時(shí)有發(fā)生[3,4]。一些天然食品擁護(hù)者聲稱野生蜂蜜比家養(yǎng)蜂蜜具有更高的營養(yǎng)價(jià)值,野蜜蜂博采百花,若所采花蜜有毒,釀制的蜂蜜或由此加工制成的蜂蜜食品也是有毒的,我國多地曾報(bào)道過多起食用野蜂蜜中毒事例[5-7],花粉有毒的植物有鉤吻、曼陀羅、醉魚草、雷公藤、狼毒、烏頭、羊躑躅、博落回、黎蘆和七黃耆等[8]。近幾年來保健食品層出不窮,特別是植物源保健食品顯著增加,被宣傳為有治療糖尿病、高血壓、肥胖等多方面的作用,然而它們存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn),給消費(fèi)者造成嚴(yán)重的健康問題,如食用了含有馬兜鈴酸的一些減肥產(chǎn)品,馬兜鈴酸具有腎毒性,已造成100多名比利時(shí)婦女出現(xiàn)腎衰竭或尿路上皮細(xì)胞癌變[9];此外使用含有麻黃的保健品時(shí),過量的麻黃生物堿類成分會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用,包括引起中風(fēng)、癲癇發(fā)作,甚至死亡[10]。歐洲食品安全局(EFSA)[11]也日益關(guān)注植物性毒素的危害,已發(fā)表了一些關(guān)于植物性毒素的科學(xué)觀點(diǎn),并列出了900多種含有有毒、易成癮、有精神作用或其他有毒有害作用物質(zhì)的植物名錄。

我國植物資源豐富,其中有毒植物數(shù)量較多,分布范圍較廣,植物性食物中毒事件時(shí)有發(fā)生,有文獻(xiàn)[12]統(tǒng)計(jì)了2004～2013年我國突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告管理信息系統(tǒng)報(bào)告中的中毒事件,植物性食物中毒共發(fā)生660起,累計(jì)報(bào)告中毒17 955人,死亡196人,病死率為1.1%,引起中毒的已知植物分布于19個(gè)科31個(gè)屬,其中烏頭、油桐、蓖麻子、發(fā)芽馬鈴薯、鉤吻等引起的事件起數(shù)和中毒人數(shù)分別占事件總起數(shù)和總中毒人數(shù)的24.5%和19.1%,烏頭引起的中毒死亡人數(shù)最多,病死率高達(dá)15.1%。

當(dāng)植物性食物中毒事件發(fā)生時(shí),有的臨床癥狀非常有特征,引起中毒的植物能被追溯,通過流行病學(xué)調(diào)查和分析可縮小可能引起中毒的毒物范圍,就可選用針對(duì)強(qiáng)的檢測方法進(jìn)行檢測。而更多的是一些不明原因的中毒事件,臨床癥狀無明顯特征,引起中毒的植物不能被明確追溯,如野蜂蜜中毒、植物源保健食品中的污染或摻假植物中毒等,對(duì)于這些中毒事件的檢測非常具有挑戰(zhàn)性,需要一種多毒素同時(shí)檢測的方法進(jìn)行檢測,只有快速檢測出引起中毒的毒物,才能指導(dǎo)臨床對(duì)因治療,有效救治患者,同時(shí)也為有關(guān)部門采取控制手段提供科學(xué)依據(jù),以防事態(tài)進(jìn)一步擴(kuò)大。

目前已有多篇文獻(xiàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法或液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜(LC-Obitrap MS)法對(duì)動(dòng)物飼料、食品、食物和植物源保健食品中多種有毒植物成分進(jìn)行檢測和篩查[13,14],也有采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(QTOF)法對(duì)引起中毒的食物進(jìn)行毒物篩查[15],還有采用LC-MS/MS法測定血液、尿液、胃液和草藥中的有毒生物堿[16-20]。Gaillard等[21]綜述了可能造成人類中毒的40種有毒植物及其相應(yīng)的檢測方法,劉亞峰等[22]對(duì)我國常見有毒植物成分的檢測方法進(jìn)行了介紹。

為了達(dá)到有毒植物成分多組分快速檢測的目的,本文選擇了84種常見有毒植物成分為目標(biāo)化合物,采用了超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Qtrap MS)技術(shù),建立了同時(shí)快速測定血漿和尿液中84種有毒植物成分的檢測方法。84種有毒植物成分中包括66種生物堿類,分別屬于烏頭類、茛菪堿類、阿片類、馬鈴薯糖苷類、馬錢子類、雷公藤類、鉤吻類、麻黃類、藜蘆類、吡咯里西啶類生物堿,以及毒芹堿、光蓋傘辛、蓖麻堿、相思豆毒素和秋水仙堿;強(qiáng)心苷類成分有黃夾苷A、夾竹桃苷和苷元;氰苷類成分有苦杏仁苷和野黑櫻苷;商陸皂苷類成分有商陸皂苷和商陸皂苷元;黃酮類成分有魚藤酮;木脂素類成分有鬼臼毒素;四環(huán)二萜類成分有3種鬧羊花毒素;硝基菲類有機(jī)酸類成分有馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸C。田麥角堿和麥角柯寧堿屬麥角類生物堿[23],毒黃素是椰毒假單胞菌產(chǎn)生的一種細(xì)菌毒素[24],以上3種毒素雖不屬于有毒植物成分,但存在于植物中;O-6-單乙酰嗎啡為海洛因體內(nèi)代謝產(chǎn)物,苯甲酰愛康寧為可卡因體內(nèi)代謝產(chǎn)物,為了測定上的方便,將它們一并納入本方法中。蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白為最強(qiáng)烈天然毒素之一,由于是大分子蛋白質(zhì),測定難度極大,因此將與它們共存的蓖麻堿和相思豆毒素作為中毒檢測的標(biāo)志物[25,26]進(jìn)行檢測。本法可以快速檢測血漿和尿液中84種有毒植物成分,檢測的毒物數(shù)量多,類別分布廣,且方法簡單快速,靈敏度高,明顯優(yōu)于文獻(xiàn)[16-20]中報(bào)道的方法,為今后有效應(yīng)對(duì)植物性食物中毒引起的公共衛(wèi)生突發(fā)事件提供可靠的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀由ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)和ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)組成,由Empower 3工作站控制,Prime HLB SPE柱(60 mg/3 mL)(美國Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀,由Analyst 1.6.2軟件控制(美國AB SCIEX公司); 3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司); 2510超聲波清洗機(jī)(美國Branson公司); MS3旋渦混旋器(德國IKA-WERKE公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國Millipore公司)。

甲醇和乙腈為液相色譜溶劑級(jí)(德國Merck公司),甲酸為液相色譜溶劑級(jí)(美國Tedia公司)。

檳榔堿、嗎啡、苦參堿、毛果蕓香堿、氧化苦參堿、加蘭他敏、麻黃堿、雙氫可待因、可待因、甲基麻黃堿、消旋山莨菪堿、東莨菪堿、O-6-單乙酰嗎啡、毒扁豆堿、苯甲酰愛康寧、阿托品、奎寧、蒂巴因、乙?？纱?、原阿片堿、罌粟堿、鬼臼毒素、那可丁、高烏甲素、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿均為化學(xué)對(duì)照品(中國生物制品檢定所); L-山梗菜堿(純度為95%)、毒黃素(純度≥98%)、4-羥基-N,N-二甲基色胺(100 mg/L)、N,N-二甲基色胺(1 000 mg/L)、黃夾苷A(對(duì)照品純度未知)、藜蘆定(純度≥90%)、α-龍葵堿(純度≥95%)和α-卡茄堿(純度≥95%)(美國Sigma公司);鉤吻堿(純度≥98%)、鉤吻素子(純度為98%)、鉤吻素己(純度為96%)、野靛堿(純度為96%)、白屈菜紅堿(純度為97%)、雷公藤吉堿(純度為95%)、雷公藤次堿(純度為97%)、馬兜鈴酸I(純度為98%)和馬兜鈴酸C(純度為98%)(云南西力生物技術(shù)公司);士的寧(純度≥98%)和馬錢子堿(純度≥98%)(德國Merck公司);苦杏仁苷(純度>97%)和相思豆毒素(對(duì)照品純度未知)(東京化成工業(yè)株式會(huì)社);夾竹桃甙(純度≥95%)、蓖麻堿(對(duì)照品純度未知)、吐根堿(純度≥90%)、野黑櫻苷(對(duì)照品純度未知)和野百合堿(對(duì)照品純度未知)(加拿大TRC公司);N-甲基野靛堿(純度≥98%)、鬧羊花毒素Ⅱ(純度≥98%)、鬧羊花毒素Ⅲ(純度≥98%)、鬧羊花毒素V(純度≥98%)、介藜蘆胺(純度≥98%)、藜蘆堿(純度≥98%)、藜蘆托素(純度≥98%)、喜樹堿(純度≥98%)、常山堿(純度≥98%)、異常山堿(純度≥98%)、秋水仙堿(純度≥98%)、商陸皂苷元(純度≥98%)和商陸皂苷甲(純度≥98%)(四川省維克奇生物科技有限公司);石斛堿(純度>98%)、駱駝蓬堿(純度>98%)、石蒜堿(純度>98%)、文多靈(純度>98%)和苯甲酰烏頭原堿(純度>98%)(大連美侖生物技術(shù)有限公司);魚藤酮(純度≥99%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司);田麥角堿(100.2 mg/L)和麥角柯寧堿(100.3 mg/L)(美國Romer公司);倒千里光堿、千里光堿和金雀花堿(對(duì)照品純度未知,美國ChromaDex公司);毒芹堿(對(duì)照品純度未知,英國Fluorochem公司);育亨賓(純度為98%)(美國J&K Scientific公司)。茄啶由發(fā)芽馬鈴薯提取的總生物堿經(jīng)2 mol/L HCl于100 ℃水解3 h后再純化制得[27];夾竹桃甙元由夾竹桃甙經(jīng)0.05 mol/L HCl甲醇液溫和酸水解后再純化制得[28];千里光堿-N-氧化物、野百合堿-N-氧化物和倒千里光堿-N-氧化物按文獻(xiàn)方法[29]由千里光堿、野百合堿和倒千里光堿經(jīng)H2O2氧化制得,再通過LC-MS/MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)阿托品-d5、秋水仙堿-d6(對(duì)照品純度未知,加拿大TRC公司),嗎啡-d3和可待因-d3混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(各20 mg/L,美國o2si公司),丁丙諾啡(對(duì)照品純度未知,中國生物制品檢定所)。

健康人血漿購自溫州市中心血站,尿液由健康人提供。

1.2 儀器條件

1.2.1色譜條件

分析柱為Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),保護(hù)柱為VanGuard BEH C18保護(hù)柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動(dòng)相A:含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸和2 mmol/L甲酸銨的97%乙腈水溶液;流動(dòng)相B:含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨水溶液。梯度洗脫程序:0～1.00 min, 2%A; 1.00～3.00 min, 2%A～10%A; 3.00～6.00 min, 10%A～12%A; 6.00～9.50 min, 12%A～40%A; 9.50～13.00 min, 40%A～93%A; 13.00～13.10 min, 93%A～98%A; 13.10～15.00 min, 98%A; 15.00～15.10 min, 98%A～2%A; 15.10～17.00 min, 2%A;流速:0.3 mL/min;柱溫:45 ℃;進(jìn)樣體積:1 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子掃描方式,多離子監(jiān)測-觸發(fā)的增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式檢測。離子化電壓(IS): 5 500 V;離子源溫度(TEM): 300 ℃;氣簾氣(CUR)壓強(qiáng):277 kPa(40 psi);噴霧氣(GS1)壓強(qiáng):483 kPa(70 psi);輔助加熱氣壓強(qiáng)(GS2): 483 kPa(70 psi);碰撞器(CAD): High。優(yōu)化后各待測物的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式相關(guān)參數(shù)見表1。增強(qiáng)子離子掃描的觸發(fā)(IDA)參數(shù):觸發(fā)閾值為1 000 cps,采用動(dòng)態(tài)背景扣除模式;增強(qiáng)子離子掃描(EPI)參數(shù):掃描速度為20 000 Da/s,掃描范圍為m/z50～900,動(dòng)態(tài)阱集時(shí)間不大于1 ms, EPI碰撞能量為50、90和130 eV。

運(yùn)行開始時(shí),色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液,1.30 min切換到離子源質(zhì)譜進(jìn)行測定采集數(shù)據(jù),直到12.7 min,再將柱流出液切換至廢液中。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

分別將84種有毒植物成分的固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用適合的溶劑溶解,用乙腈定容,制成1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,然后混合,配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-70 ℃保存。臨用時(shí)再用40%甲醇水溶液稀釋成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

阿托品-d5、秋水仙堿-d6和丁丙諾啡用甲醇溶解,配制成100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液,然后用40%甲醇水溶液稀釋5種內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液,配制成混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,其中嗎啡-d3的質(zhì)量濃度為0.10 mg/L,可待因-d3的質(zhì)量濃度為0.10 mg/L,阿托品-d5的質(zhì)量濃度為0.10 mg/L,秋水仙堿-d6的質(zhì)量濃度為0.10 mg/L,丁丙諾啡的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L。

1.4 樣品前處理方法

吸取500 μL血漿于5 mL Eppendorf管中,加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,混勻,再加入2.0 mL乙腈,旋渦30 s,超聲提取5 min,以10 000 r/min的速度離心5 min,上清液再通過除磷脂柱Prime HLB SPE柱(60 mg/3 mL),重力自然流出,流出液用氮?dú)獯蹈珊?殘?jiān)苡?00 μL 40%甲醇水溶液中,渦旋15 s,轉(zhuǎn)移至1 mL Eppendorf管中,以15 000 r/min的速度離心5 min,移取上清液至微量自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,待測。

吸取1 000 μL尿液于2 mL Eppendorf管中,加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和700 μL甲醇,混勻,以15 000 r/min的速度離心5 min,移取上清液至自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,待測。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別在7份各500 μL空白血漿中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使各待測物質(zhì)量濃度分別為0.03、0.3、1.0、5.0、10.0、20.0、100 μg/L。在7只2 mL Eppendorf管中加入小體積適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,再加入空白尿液至1 000 μL,使各待測物的質(zhì)量濃度分別為0.30、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、200 μg/L。再分別按1.4節(jié)進(jìn)行樣品前處理后再測定,采用MultiQuant定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y)對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重取1/x)。

1.5.2準(zhǔn)確度和精密度

在血漿中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,使各待測物質(zhì)量濃度分別為0.30、1.0、5.0、20.0和80.0 μg/L,在尿液中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,使各待測物質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、20.0和180 μg/L,每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行試驗(yàn)6次,一個(gè)工作日內(nèi)進(jìn)行測定,計(jì)算日內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度。在3個(gè)連續(xù)的工作日對(duì)上述加標(biāo)濃度水平的樣品進(jìn)行測定,計(jì)算日間準(zhǔn)確度和精密度,每個(gè)濃度水平平行試驗(yàn)6次。通過測量濃度與加標(biāo)濃度的百分比來表示準(zhǔn)確度,通過測量濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)來評(píng)估精密度。

1.5.3基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

通過計(jì)算空白血漿或尿液經(jīng)樣品前處理后加入待測物的峰面積與含有相同濃度水平的溶劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積的比值進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估[30]。血漿中84種有毒植物成分質(zhì)量濃度水平分別為0.30、1.0、5.0、20.0和80.0 μg/L,尿液中84種有毒植物成分質(zhì)量濃度水平分別為1.0、5.0、20.0、80.0和180.0 μg/L,平行試驗(yàn)5次。

通過計(jì)算加標(biāo)樣品中待測物的峰面積與空白血漿提取后加入相同濃度水平待測物的峰面積的比值來確定提取回收率?？瞻籽獫{加標(biāo)水平分別為0.30、1.0、5.0、20.0和80.0 μg/L,平行試驗(yàn)5次。尿液樣品用甲醇稀釋后直接進(jìn)樣測定。由于尿液中待測物的濃度比較低,加入甲醇稀釋有更好的溶解作用,避免接觸材料的吸附,不會(huì)造成損失,故不再評(píng)估其提取回收率。

在丁丙諾啡為50 μg/L、其他4種內(nèi)標(biāo)物為5.0μg/L的水平下,用相同的方法測定了血漿中內(nèi)標(biāo)物的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

1.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品提取后在室溫于自動(dòng)進(jìn)樣器上放置72 h,每隔24 h測定1次。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將配制的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別通過注射泵注入質(zhì)譜儀中,進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。在電噴霧正離子電離模式下,除苦杏仁苷、野黑櫻苷、鬧羊花毒素Ⅲ、黃夾苷A、馬兜鈴酸C、商陸皂苷甲、商陸皂苷元和馬兜鈴酸I在第1級(jí)四極桿全掃描時(shí)出現(xiàn)[M+NH4]+峰、鬧羊花毒素V出現(xiàn)[M-H2O+H]+峰外,其余化合物均出現(xiàn)[M+H]+峰。以這些加合物作為母離子進(jìn)行碰撞解離,通過子離子掃描得到目標(biāo)化合物碎片離子信息,然后再對(duì)去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使分子離子對(duì)的信號(hào)達(dá)到最高。每種有毒植物成分選擇響應(yīng)最高的兩對(duì)分子離子對(duì),以其中響應(yīng)高的分子離子對(duì)作為定量離子對(duì),另一分子離子對(duì)作為定性離子對(duì)。設(shè)置MRM檢測窗口為各待測物色譜峰的保留時(shí)間±30 s,各目標(biāo)物掃描時(shí)間(target scan time)為0.2 s,由Analyst軟件自動(dòng)生成Scheduled MRM參數(shù),自動(dòng)設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間(dwell time),使色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)在12～20之間,得到較好的定量重復(fù)性。然后對(duì)離子化電壓、離子源溫度、氣簾氣壓強(qiáng)、噴霧氣壓強(qiáng)和輔助加熱氣壓強(qiáng)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),較低的離子源溫度有利于[M+NH4]+加合物的生成,使這些化合物的響應(yīng)值較高,故選擇300 ℃的離子源溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

考慮到某些中毒樣品中有毒植物成分含量較低,加上尿液和血漿中的基質(zhì)成分非常復(fù)雜,采用MRM法進(jìn)行分析時(shí),如果質(zhì)譜響應(yīng)值比較低,目標(biāo)有毒植物成分容易受到基質(zhì)成分的影響,定性離子和定量離子豐度比值可能會(huì)超出容許范圍,會(huì)影響定性判定,容易造成假陽性或假陰性的結(jié)果。采用多離子監(jiān)測觸發(fā)的增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式進(jìn)行檢測,利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自建增強(qiáng)子離子掃描譜庫,檢測時(shí)通過子離子譜庫檢索和匹配,可提高定性能力,更有利于復(fù)雜基質(zhì)條件下的痕量有毒植物成分的準(zhǔn)確定性。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.2.2節(jié)。

2.2 超高效液相色譜條件優(yōu)化

考慮到方法的通用性,試驗(yàn)選擇了比較常用的Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)作為分析柱進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。由于苦杏仁苷、野黑櫻苷、鬧羊花毒素Ⅲ、黃夾苷A、馬兜鈴酸C、商陸皂苷甲、商陸皂苷元、馬兜鈴酸I的質(zhì)譜母離子為[M+NH4]+,因此流動(dòng)相中應(yīng)含有氨或銨鹽?？紤]到流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)值影響很大,有文獻(xiàn)[31]報(bào)道堿性流動(dòng)相可以改善阿片生物堿等堿性化合物的色譜行為,色譜保留能力增強(qiáng),可在較高有機(jī)相比例下洗脫,從而提高電噴霧離子化效率,大部分待測物的響應(yīng)值有數(shù)倍增加,因此嘗試采用堿性流動(dòng)相(0.05%氨水乙腈溶液-0.05%氨水溶液),并與中性流動(dòng)相(乙腈-5 mmol/L甲酸銨的水溶液)和酸性流動(dòng)相(含有0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的97%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨水溶液)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,在堿性流動(dòng)相下,絕大多數(shù)待測物的響應(yīng)值比中性和酸性流動(dòng)相均有數(shù)倍乃至數(shù)十倍的提高,但遺憾的是α-龍葵堿、α-卡茄堿和茄啶的響應(yīng)值很低,不能應(yīng)用于血漿和尿液中低濃度的測定,考慮到α-龍葵堿、α-卡茄堿和茄啶為發(fā)芽馬鈴薯引起中毒的標(biāo)志物[27],非常重要,故不采用堿性流動(dòng)相。中性流動(dòng)相與酸性流動(dòng)相大部分待測物的響應(yīng)值相當(dāng)或互有高低,但靈敏度不高的苦杏仁苷、馬兜鈴酸I、野靛堿、商陸皂苷元、鬧羊花毒素Ⅲ等成分在酸性流動(dòng)相條件下的響應(yīng)值比中性流動(dòng)相要高,因此選擇酸性流動(dòng)相。

對(duì)酸性流動(dòng)相中的甲酸、甲酸銨的濃度以及強(qiáng)洗脫成分(乙腈和甲醇)進(jìn)行比較、優(yōu)化,最終選擇含有0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的97%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨的水溶液作為色譜分離的流動(dòng)相,考慮到后續(xù)血漿樣品采用的預(yù)處理方法,尿液樣品為稀釋后直接進(jìn)樣分析,樣品進(jìn)樣液比較臟,基質(zhì)成分復(fù)雜,因此采用比較平穩(wěn)的梯度洗脫程序進(jìn)行分離,期望盡可能地將有毒植物成分與基質(zhì)成分更好地分離。優(yōu)化好的色譜分析條件見1.2.1節(jié)。分別取6份不同來源的空白血漿和尿液按本法進(jìn)行測定,樣品中內(nèi)源性基質(zhì)成分不干擾84種待測物的測定。

由于本研究測定的化合物極性分布跨度大,既有強(qiáng)極性成分,又有弱極性成分,而血漿和尿液樣品進(jìn)行前處理時(shí)使用的Eppendorf管、槍頭等均為有機(jī)高分子材料,會(huì)吸附弱極性化合物,如雷公藤次堿、魚藤酮、雷公藤吉堿和馬兜鈴酸I等,經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)溶液中甲醇體積分?jǐn)?shù)≥40%時(shí),弱極性待測物不會(huì)被吸附,因此樣品的進(jìn)樣溶劑選擇40%甲醇水溶液。

對(duì)進(jìn)樣體積進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,1 μL的進(jìn)樣體積不會(huì)引起明顯的進(jìn)樣溶劑效應(yīng),最終樣品進(jìn)樣體積確定為1 μL。

圖 1 血漿加標(biāo)樣品乙腈沉淀去蛋白再過Prime HLB SPE 柱的MRM總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms obtained for the analysis of spiked plasma treated by acetonitrile precipitation for protein removal followed by phospholipid removal on a Prime HLB SPE column a. total ion chromatogram of 84 analytes; b. total ion chromatogram of phospholipids.

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

圖 2 血漿加標(biāo)樣品乙腈沉淀去蛋白后的MRM總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms obtained for the analysis of spiked plasma treated by acetonitrile precipitation for protein removal a. total ion chromatogram of 84 analytes; b. total ion chromatogram of phospholipids.

本法測定的有毒植物成分種類較多,化學(xué)性質(zhì)各異,有堿性、酸性、中性和酸堿兩性,極性分布范圍廣,不能采用液液萃取法進(jìn)行凈化。考慮到中毒發(fā)生時(shí),毒物在血漿中濃度較低,通常比尿液中的濃度要低數(shù)倍乃至數(shù)十倍,而進(jìn)樣體積只有1 μL,因此需要對(duì)血漿樣品進(jìn)行濃縮。血漿樣品最常用的樣品前處理方法有蛋白沉淀法和除磷脂法,因此對(duì)二者進(jìn)行比較。除磷脂法按1.4節(jié)進(jìn)行處理,同時(shí)在質(zhì)譜方法中增加1個(gè)通道,設(shè)置分子離子對(duì)為m/z184.2>m/z184.2、去簇電壓為250 V、碰撞能量為10 eV來監(jiān)測磷脂出峰時(shí)間及強(qiáng)度,得到的色譜圖見圖1。蛋白沉淀法也按1.4節(jié)進(jìn)行處理,但省略除磷脂步驟,質(zhì)譜方法與除磷脂法一樣,進(jìn)樣分析獲得色譜圖(見圖2)。比較圖1和圖2可知,通過除磷脂柱除去的磷脂主要集中于色譜強(qiáng)洗脫劑洗出的流分中(保留時(shí)間(tR)>12.7 min),蛋白沉淀法處理的樣品液中大量磷脂是在84種有毒植物成分中最后出峰的魚藤酮之后才出峰,雖然不影響測定,但考慮到方法的穩(wěn)健性和耐受性,最終還是采用過Prime HLB SPE柱的除磷脂法,這樣有助于儀器保持較長時(shí)間的良好狀態(tài)。同時(shí)通過切換閥將12.7 min之后流出的磷脂切換至廢液中,而不進(jìn)入質(zhì)譜污染系統(tǒng)。樣品雖然經(jīng)蛋白沉淀和除磷脂處理的最后樣品液還有少量蛋白存在,略顯渾濁,但此時(shí)不能過濾膜,因?yàn)闉V膜會(huì)吸附部分弱極性化合物,可以以15 000 r/min的速度離心5 min去除蛋白,取上清液進(jìn)樣分析。

尿液采用甲醇稀釋后直接進(jìn)樣測定,在1 000 μL尿液樣品中加入700 μL甲醇使甲醇的體積分?jǐn)?shù)>40%,不能用濾膜過濾,可以以15 000 r/min的速度離心5 min去除沉淀,取上清液進(jìn)樣分析。

再結(jié)合閥切換法將N-甲基野靛堿之前流出的色譜柱弱保留雜質(zhì)和魚藤酮之后出峰的強(qiáng)保留雜質(zhì)切換至廢液,而不污染質(zhì)譜系統(tǒng)。

2.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

采用內(nèi)標(biāo)法定量可以校正待測物在樣品前處理中的損失、質(zhì)譜測定過程中的基質(zhì)效應(yīng)等,從而得到更好的準(zhǔn)確度和精密度。最理想的是采用穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量檢測,由于本法測定化合物比較多,經(jīng)過試驗(yàn)最終選用嗎啡-d3、可待因-d3、阿托品-d5、秋水仙堿-d6和丁丙諾啡作為內(nèi)標(biāo)物,按色譜保留時(shí)間分區(qū)間進(jìn)行校正,具體見表2。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1方法的線性范圍、檢出限和定量限

84種有毒植物成分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2,相關(guān)系數(shù)均≥0.991 1,線性關(guān)系良好。

在空白血漿和尿液樣品中分別加入低濃度的有毒植物成分進(jìn)行測定,以分子離子對(duì)的信噪比≥3時(shí)的樣品濃度作為檢出限(LOD),以信噪比≥10時(shí)的樣品濃度作為定量限(LOQ),試驗(yàn)測得血漿和尿液中84種有毒植物成分的檢出限和定量限(見表2)。血漿和尿液中84種有毒植物成分的檢出限分別為0.01～1 μg/L和0.03～2 μg/L,能夠滿足中毒檢測的要求。

2.5.2樣品準(zhǔn)確度和精密度

84種有毒植物成分的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果列于附表1(詳見http://www.chrom-China.com),分析物的日內(nèi)和日間精密度分別為0.7%～18.4%和1.1%～18.5%,準(zhǔn)確度為70.6%～124.5%,結(jié)果符合中毒檢測要求,結(jié)果表明該方法對(duì)血漿和尿液中84種有毒植物成分的檢測具有較高的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。

2.5.3基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率見附表1(詳見http://www.chrom-China.com)。在4個(gè)質(zhì)量濃度水平下,84種有毒植物成分在血漿中基質(zhì)效應(yīng)為51.96%～127.39%,回收率為43.86%～112.69%,而尿液中基質(zhì)效應(yīng)為27.57%～136.80%。在5.0 μg/L水平下,5種內(nèi)標(biāo)物的血漿和尿液的基質(zhì)效應(yīng)分別為75.60%～88.33%和60.76%～112.41%,血漿的提取回收率為88.76%～105.05%。以上結(jié)果表明,雖然樣品中某些化合物的基質(zhì)效應(yīng)較明顯(如尿液中氧化苦參堿和加蘭他敏、血漿中檳榔堿和馬兜鈴酸C表現(xiàn)出一定的基質(zhì)抑制效應(yīng);尿液中商陸皂苷元、馬兜鈴酸I、喜樹堿、鬧羊花毒素Ⅱ、育亨賓、乙酰可待因、鬧羊花毒素Ⅴ、吐根堿和苦杏仁苷等,以及血漿中育亨賓均有一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)),但對(duì)于多毒素同時(shí)測定的方法,這些有毒植物成分的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率還是可以接受的,通過基質(zhì)加標(biāo)內(nèi)標(biāo)法校正能夠得到比較滿意的結(jié)果,符合中毒生物樣品的快速檢測的要求,結(jié)果表明,本方法仍不失為一種可行的檢測方法。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

當(dāng)提取的樣品于室溫保存,72 h內(nèi)84種有毒植物成分沒有發(fā)生明顯的降解。

2.6 實(shí)際樣品的測定

對(duì)2012年7月2日溫州市發(fā)生的一起誤服摻有烏頭類藥酒的楊梅白酒中毒事件[32,33]的血漿和尿液留樣樣品進(jìn)行重新檢測。血漿樣品和尿液樣品中分別測得苯甲酰烏頭原堿的質(zhì)量濃度為0.47和26.4 μg/L(當(dāng)時(shí)缺少該成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),沒有測定此項(xiàng)目)。血漿樣品中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿均未檢出;尿液樣品中烏頭堿為12.7 μg/L,中烏頭堿和次烏頭堿均未檢出。檢出陽性有毒植物成分的MRM色譜圖和增強(qiáng)子離子掃描譜圖見圖3。本次測得的濃度遠(yuǎn)低于原來的結(jié)果,可能與樣品經(jīng)過長時(shí)間的冷藏保存后,樣品中含有的內(nèi)源性酯類水解酶會(huì)分解烏頭類生物堿的原因有關(guān),已有文獻(xiàn)[34,35]報(bào)道,烏頭類生物堿在體內(nèi)代謝迅速,半衰期僅為2 min。

圖 3 血漿和尿液樣品檢出苯甲酰烏頭原堿和烏頭堿的MRM總離子流色譜圖和增強(qiáng)子離子掃描譜圖Fig. 3 Total ion chromatograms and enhanced product ion scan spectra of benzoylaconine and aconitine in plasma and urine a. benzoylaconine in plasma; b. benzoylaconine in urine; c. aconitine in urine.

對(duì)2017年5月21日發(fā)生在沈陽市的某老農(nóng)因食用發(fā)芽馬鈴薯發(fā)生中毒的血漿和尿液留樣樣品進(jìn)行重新檢測,測得血漿中α-龍葵堿的質(zhì)量濃度為1.11 μg/L,α-卡茄堿的質(zhì)量濃度為3.32 μg/L,茄啶未檢出;尿液樣品中α-龍葵堿的質(zhì)量濃度為0.62 μg/L,α-卡茄堿的質(zhì)量濃度為0.75 μg/L,茄啶未檢出。檢出陽性成分的MRM色譜圖和增強(qiáng)子離子掃描譜圖見圖4。血漿中原測定值α-龍葵堿的質(zhì)量濃度為3.3 μg/L,α-卡茄堿的質(zhì)量濃度為7.8 μg/L,茄啶的質(zhì)量濃度為3.1 μg/L(中毒4 h后采集的血清樣品);尿液樣品中原測定值α-龍葵堿的質(zhì)量濃度為0.70 μg/L,α-卡茄堿的質(zhì)量濃度為1.5 μg/L,茄啶的質(zhì)量濃度為0.1 μg/L(中毒后第2天采集的尿液樣品)。血漿中馬鈴薯生物堿的結(jié)果低于原來的結(jié)果,可能與樣品經(jīng)過長時(shí)間的冷藏保存,樣品中待測物分解有關(guān)。

圖 4 血漿和尿液樣品檢出α-龍葵堿和α-卡茄堿的MRM總離子流色譜圖和增強(qiáng)子離子掃描譜圖Fig. 4 Total ion chromatograms and enhanced product ion scan spectrum of α-solanine and α-chaconine in plasma and urine

3 小結(jié)

本文建立了測定血漿和尿液中84種有毒植物成分的超高液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱的質(zhì)譜檢測方法。通過對(duì)樣品基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的評(píng)估,驗(yàn)證了樣品前處理方法的有效性,通過對(duì)超高效液相色譜與質(zhì)譜的檢測條件的優(yōu)化,得到了較好的檢測靈敏度,自建84種有毒植物成分的增強(qiáng)子離子掃描譜庫,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了MRM定量檢測和增強(qiáng)子離子掃描譜庫檢索定性確證的雙重功能,進(jìn)一步提高了復(fù)雜基質(zhì)條件下低濃度待測物的定性能力。方法學(xué)考察表明,該方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測取得滿意結(jié)果。本法適用于血漿和尿液中多種有毒植物成分的快速中毒檢測和臨床監(jiān)測,今后也可進(jìn)一步拓展應(yīng)用于植物和植物源保健食品中有毒成分的檢測。