高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查保健食品中的西布曲明及其5種衍生物

洪 燈, 謝 文, 侯建波, 胡曉莉, 史穎珠, 李 杰

(浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 浙江 杭州 311215)

西布曲明(sibutramine),化學(xué)名為1-(4-氯苯基)-N,N-二甲基-α-(2-甲基丙基)環(huán)丁甲胺,化學(xué)式為C17H26ClN,白色結(jié)晶性粉末,主要用于肥胖癥的治療,結(jié)構(gòu)式見圖1。西布曲明是一種中樞神經(jīng)抑制劑,可抑制去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的再攝取,長期服用可引起血壓升高,心率加快、厭食、肝功能異常、心律失常或中風(fēng)等,重者可危及生命[1,2]。由于有增加心臟病的風(fēng)險,2010年10月以后美國、澳洲、歐盟等國已陸續(xù)廢止該藥品的許可證,并令制藥廠回收。2010年10月30日,中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局宣布國內(nèi)停止生產(chǎn)、銷售和使用西布曲明制劑和原料藥,撤銷其批準(zhǔn)證明文件,已上市銷售的藥品由生產(chǎn)企業(yè)負(fù)責(zé)召回銷毀。

圖 1 西布曲明及其5個衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structural formulas of sibutramine and its five derivatives

2006年國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項目批準(zhǔn)件2006004[3],用于檢測中成藥和保健食品中非法添加的西布曲明化合物,但是不法商人為了追求產(chǎn)品的減肥效果,同時為了逃避法定方法的檢測,他們改為添加新型西布曲明衍生物。芐基西布曲明、氯代西布曲明和豪莫西布曲明就是新近出現(xiàn)的新型西布曲明類化合物,結(jié)構(gòu)式見圖1。由于這些化合物未經(jīng)臨床前的安全性考察,對人產(chǎn)生的不良反應(yīng)未知,其產(chǎn)生的危害可能更大[4]。因發(fā)現(xiàn)時間不長,目前仍缺少相應(yīng)的定性定量分析方法。

目前西布曲明的檢測方法主要為液相色譜法(HPLC)[5-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-12]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[13],此外也有紅外光譜法[14]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[15]、離子遷移色譜法[16,17]等報道。但這些已經(jīng)報道的方法基本只檢測西布曲明,或者N-單去甲基西布曲明和N,N-雙去甲基西布曲明等幾種常見衍生物。胡等[18]報道了使用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測食品中西布曲明及其5種衍生物的方法,實(shí)現(xiàn)了保健食品中多組分的同時定性、定量分析,滿足高靈敏度檢測要求,但在檢測過程中需要有目標(biāo)化合物進(jìn)行對照,且不能對未知化合物進(jìn)行篩查。

高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜(HPLC-Q/Orbitrap HRMS)能進(jìn)行高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物篩查,能夠?qū)崿F(xiàn)高可靠性的確證和定量分析,目前已被廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域小分子和大分子的研究[19-23],但尚沒有使用HPLC-Q/Orbitrap HRMS對保健食品中西布曲明及其衍生物進(jìn)行檢測的報道。HPLC-Q/Orbitrap HRMS具有高分辨率和高選擇性,在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下根據(jù)精確分子質(zhì)量及裂解規(guī)律也能進(jìn)行化合物的快速篩查。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-Q/Orbitrap HRMS對保健食品中的西布曲明及其5種衍生物快速定量篩查,并對其質(zhì)譜裂解可能途徑進(jìn)行推測。在實(shí)際工作中可根據(jù)二級特征離子快速篩查西布曲明類物質(zhì),再結(jié)合裂解規(guī)律推測化合物的可能結(jié)構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)對非目標(biāo)化合物的篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)及Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司); AB204-S/A型電子天平(瑞士梅特勒公司); Elmasonic P型超聲儀(德國Elma公司); 1-16K型高速離心機(jī)(德國Sigma公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

鹽酸西布曲明(CAS號125494-59-9,純度99.9%)、鹽酸N-單去甲基西布曲明(CAS號84467-947,純度98.8%)和鹽酸N,N-雙去甲基西布曲明(CAS號84484-786,純度98.9%)購于中國藥品生物制品檢定所;鹽酸芐基西布曲明(CAS號1446140-91-5,純度99.9%)、鹽酸豪莫西布曲明(CAS號935888-80-5,純度98.5%)和鹽酸氯代西布曲明(CAS號84485-08-5, 純度98.7%)購于TLC Pharmachem公司。

甲醇(色譜純,德國Merck公司);乙腈(色譜純)和甲酸(LC-MS級)(西班牙Scharlau公司); 0.22 μm水系濾膜(天津津滕公司);實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱:Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm, 3 μm, 美國Thermo Fisher Scientific公司);流動相A為0.15%(v/v)甲酸水溶液,B為甲醇,梯度洗脫程序:0～2.0 min, 70%A～5%A; 2.0～6.0 min, 5%A; 6.0～6.2 min, 5%A～70%A; 6.2～8.0 min, 70%A;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;柱溫25 ℃。

1.2.2質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子源(HESI);正離子模式;離子源溫度350 ℃;毛細(xì)管溫度320 ℃;噴霧電壓3 500 V;輔助氣:15 arb;鞘氣:40 arb;掃描模式:正離子全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描(Full MS/dd-MS2);Full MS分辨率(R)70 000, Orbitrap最大容量(AGC target) 1×106, Orbitrap最大注入時間100 ms,質(zhì)量掃描范圍m/z200～350;dd-MS2分辨率17 500,Orbitrap最大容量1×105, Orbitrap最大注入時間50 ms;歸一化碰撞能量(NCE): 30。各個化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品適量,加甲醇制成目標(biāo)物質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;再經(jīng)梯度稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于4 ℃冰箱貯存。

1.2.4樣品前處理

取保健品片劑、膠囊或顆粒,研細(xì),準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,置于50 mL容量瓶中,加入適量甲醇,超聲提取15 min,冷卻至室溫后加甲醇定容,高速離心5 min后,經(jīng)0.22 μm濾膜后待上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱與色譜條件的優(yōu)化

分別考察了Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm, 3 μm)和Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm, 3 μm)2種類型的色譜柱對6種目標(biāo)物的分離效果,優(yōu)化流動相后Zorbax SB-C18色譜柱在10 min以后出峰,而Hypersil Gold色譜柱在4 min左右出峰,具有出峰早、分離周期短、分離效率更高的優(yōu)點(diǎn),故本研究采用Hypersil Gold色譜柱進(jìn)行分離。

為了獲得良好的分離效果和峰形,我們對流動相進(jìn)行了考察。比較水-甲醇、水-乙腈、0.15%(v/v)甲酸水溶液-甲醇、0.15%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相的分離效果。由于西布曲明類均為含N化合物,其易得到一個質(zhì)子形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,加入甲酸能夠明顯改善目標(biāo)化合物的峰形。甲醇的分離效果略優(yōu)于乙腈,且同等濃度下具有更大的響應(yīng)強(qiáng)度。從提取離子色譜圖上看,該6種組分沒有實(shí)現(xiàn)基線分離,但是其m/z完全不同,不影響其識別、確證和定量,因此最終確定0.15%(v/v)甲酸水溶液-甲醇體系為最佳流動相體系。圖2為加標(biāo)水平為100 μg/kg的西布曲明及其5個衍生物的一級分子離子峰提取離子色譜圖。

2.2 線性方程、檢出限與定量限

將西布曲明及其5種衍生物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,以各物質(zhì)的一級高分辨準(zhǔn)分子離子峰的色譜峰面積(y)對各物質(zhì)的質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。所有的化合物在合適的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)大于0.999。在空白的保健品樣品基質(zhì)中添加低濃度的目標(biāo)化合物,以3倍信噪比(S/N=3)時對應(yīng)的含量為該化合物的檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)時對應(yīng)的含量為方法的定量限(LOQ),結(jié)果見表2。

表 1 6種分析物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of the six analytes

圖 2 加標(biāo)水平100 μg/kg的西布曲明及其 5個衍生物的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of sibutramine and its five derivatives at a spiked level of 100 μg/kg

2.3 回收率與精密度

采用分別在空白的固體類保健食品和液體類保健食品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行添加回收率測定和方法的精密度測定,添加水平分別為25、100和500 μg/kg,每個濃度水平平行測定6次,測得這6種化合物的回收率范圍為93.5%～103.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)范圍為1.5%～7.7%,該法的回收率和精密度符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范[24]要求,能夠滿足不同劑型樣品的分析要求,可用于日常分析的檢測?；厥章屎途芏仍囼?yàn)結(jié)果見表3。

2.4 裂解規(guī)律的推測及應(yīng)用

基于西布曲明的二級特征離子質(zhì)譜圖(見圖3),推測西布曲明可能的裂解途徑(見圖4):先脫去中性二甲胺分子形成m/z235.124 80的碎片,一方面通過1, 3-氫遷移后脫去異丁烯,形成m/z179.062 20離子碎片,另一方面脫去異戊烯,形成m/z165.046 55的四元環(huán)正離子碎片。四元環(huán)開環(huán)以后形成穩(wěn)定的153.046 55、139.030 90、m/z125.015 25的特征碎片。m/z為125.015 25的芐基正離子是質(zhì)譜碎片中的基峰。

表 2 各個化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equation, correlation coefficient (R2), limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) of each compound

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 西布曲明及其衍生物的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of sibutramine and its derivatives (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

圖 4 西布曲明及其衍生物可能的裂解途徑Fig. 4 Possible fragmentation pathways of sibutramine and its derivatives

圖 3 西布曲明的二級特征離子質(zhì)譜圖Fig. 3 Secondary characteristic ion mass spectrum of sibutramine

N-單去甲基西布曲明,N,N-雙去甲基西布曲明和豪莫西布曲明這3個衍生物的裂解方式與西布曲明相似。芐基西布曲明脫去二甲胺形成m/z269.109 15碎片后,更容易發(fā)生1, 2-氫遷移形成穩(wěn)定的m/z91.054 23芐基特征離子碎片,然后發(fā)生和西布曲明一樣的裂解過程。

西布曲明苯環(huán)上的一個氫被氯原子取代即得到氯代西布曲明,其準(zhǔn)分子離子峰的m/z比西布曲明的大34,同時其多級特征碎片離子(m/z158.976 28, 172.991 93, 187.007 58)均比西布曲明的特征碎片離子大34,與其準(zhǔn)分子離子峰差值相同,說明脫去的碎片為它們結(jié)構(gòu)中相同的部分,氯代西布曲明裂解方式與西布曲明相同。

高分辨質(zhì)譜檢測器具有高分辨率和高選擇性,在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下根據(jù)精確分子質(zhì)量及裂解規(guī)律也能進(jìn)行化合物的快速篩查。通過對6種化合物的質(zhì)譜裂解方式進(jìn)行探索,根據(jù)西布曲明的裂解規(guī)律可推測在裂解過程中均能產(chǎn)生m/z分別為125.015 25和139.030 90這兩個二級特征碎片離子,在實(shí)際工作中可根據(jù)這兩個特征離子快速篩查西布曲明類物質(zhì),再結(jié)合裂解規(guī)律推測化合物的可能結(jié)構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)對非目標(biāo)化合物的篩查。

2.5 實(shí)際樣品的測試

應(yīng)用所建立的快速篩選方法對60種國內(nèi)外常見的減肥類保健食品中的西布曲明及其5種衍生物進(jìn)行檢測。其中4種保健食品中檢出西布曲明成分,含量分別為56.8 mg/kg、73 150 mg/kg、73 450 mg/kg和88 900 mg/kg;2種樣品中檢出N-單去甲基西布曲明成分,含量分別為47.4 mg/kg和60.2 mg/kg；2種樣品中檢出N,N-雙去甲基西布曲明成分,含量分別為5.35 mg/kg和5.93 mg/kg?？梢姕p肥類保健食品中西布曲明及其衍生物的非法添加現(xiàn)象存在。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)建立了減肥類保健食品中西布曲明及其5種衍生物的快速篩查和定量分析方法。依靠一級高分辨準(zhǔn)分子離子峰定量,二級特征離子定性,6種化合物的精確質(zhì)量相對偏差均小于1×10-6。文中還對6種化合物的質(zhì)譜裂解方式進(jìn)行了探索。研究結(jié)果表明本方法具有前處理簡單、快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、高選擇性等特點(diǎn),能夠滿足保健食品中西布曲明及其衍生物等減肥類非法添加物的快速篩選分析需要。