溫和條件下柱前標(biāo)記-高效液相色譜-質(zhì)譜法測定枸杞多糖中單糖組成

趙孟欣, 王澤嵐, 孟 哲, 李吉光, 李和平, 劉萬毅

(寧夏大學(xué),省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,化學(xué)化工學(xué)院, 寧夏 銀川 750021)

植物多糖(plant polysaccharide)是從植物中提取得到的一種富含醛單糖(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等)和酮單糖(果糖)、通過糖苷鍵連接在一起形成的多聚物。大量研究證明,許多植物多糖均具有多種生物活性和生理功能,如免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤[2,3]、抗氧化[4,5]、抗疲勞[6]、控制血糖[7]以及保護(hù)肝功能等[8],而且對(duì)機(jī)體無毒副作用。近幾十年,已有近10種植物多糖(如枸杞多糖、香菇多糖、人參多糖以及豬苓多糖等)用于抗腫瘤、抗艾滋病及糖尿病治療,并已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[9]。在植物多糖的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)及其構(gòu)效關(guān)系的研究中,單糖組成是最基本的和最關(guān)鍵性的研究對(duì)象。目前,植物多糖類藥品、食品和保健品紛涌上市,這些產(chǎn)品的質(zhì)量控制引起了人們的極大關(guān)注。因此,為確保植物多糖質(zhì)量可控,統(tǒng)一規(guī)范植物多糖中典型單糖分布將成為一個(gè)非常重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。

植物多糖中單糖組成分析包括多糖水解為單糖、單糖間的相互分離及對(duì)逐個(gè)分離的單糖進(jìn)行檢測。其中植物多糖大分子的降解方法有多種,包括超聲波[10,11]、酶催化[12,13]、堿催化[14]、酸催化[15-17]等,其中采用易揮發(fā)的三氟乙酸在120 ℃下進(jìn)行多糖水解是目前的主流技術(shù)。圍繞單糖組成的檢測分析領(lǐng)域也取得了較大的研究進(jìn)展,但仍存在一些問題。由于單糖分子結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)色基團(tuán),一定程度上限制了對(duì)單糖組成的分析檢測。為在單糖組成分析過程中獲得較高的檢測靈敏度,單糖分子的化學(xué)衍生化成為認(rèn)識(shí)單糖組成研究的熱點(diǎn)。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是一種可以在強(qiáng)堿性的NaOH條件下與醛單糖反應(yīng)的通用化學(xué)修飾試劑,其衍生化條件及其衍生化機(jī)理均有報(bào)道[18-20]。但不足的是,同樣在強(qiáng)堿性NaOH條件下,PMP無法修飾酮單糖(果糖)沒有引起人們的關(guān)注。果糖是一種大量存在的重要天然酮單糖,其同分異構(gòu)體為吡喃型果糖和呋喃型果糖(如圖1)。研究表明,呋喃型果糖能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁,并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用[9,21]。因此,了解果糖在枸杞多糖中的分布尤為重要。目前,采用PMP衍生化植物多糖水解產(chǎn)物而鑒定果糖分布的研究很少有報(bào)道[21]。預(yù)測果糖的構(gòu)型和同時(shí)鑒定枸杞多糖中多種醛單糖和酮單糖的研究尚未見報(bào)道。

圖 1 果糖的同分異構(gòu)體Fig. 1 Isomers of fructose

本文建立了一種在溫和NH3·H2O條件下,PMP衍生化多糖水解產(chǎn)物中醛單糖和酮單糖(果糖)的測定方法。該法用于4個(gè)地區(qū)枸杞多糖中單糖組成的測定,獲得了不同地區(qū)種植的枸杞多糖中果糖和多種醛單糖含量的分布,為確保植物多糖質(zhì)量可控及了解多糖中典型單糖的分布具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS-2010EV,日本Shimadzu公司);色譜柱:Kromasil-C18(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm); KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司); LGJ-10C真空冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司); JC-ZF型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海丹鼎國際貿(mào)易有限公司)。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品:果糖(fructose, Fruc)、葡萄糖(glucose, Glu)、鼠李糖(rhamnose, Rha)、木糖(xylose, Xyl)、阿拉伯糖(arabinose, Ara)、甘露糖(mannose, Man)、半乳糖(galactose, Gal)、脫氧核糖(ribose, Rib)(純度>99%,上海中秦化學(xué)試劑有限公司);雙糖標(biāo)準(zhǔn)品:蔗糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)(純度>99%,上海中秦化學(xué)試劑有限公司);衍生化試劑:PMP(上海晶純?cè)噭┯邢薰?;透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000,上海新睿生物科技有限公司); SZ-97自動(dòng)三重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);氨水、鹽酸、氫氧化鈉及三氟乙酸(TFA)等其余試劑為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.018 0 g單糖標(biāo)準(zhǔn)品,用氨水定容至5 mL,各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為3 600 mg/L,儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中備用。

分別準(zhǔn)確稱取8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各0.036 g,用濃氨水(28%)定容至10 mL,混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中各單糖的質(zhì)量濃度均為3 600 mg/L,儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中備用。

準(zhǔn)確移取不同體積的上述混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(3 600 mg/L),用氨水稀釋成系列質(zhì)量濃度(0.18～38.8 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

從市場購買4個(gè)地區(qū)種植的枸杞干果。1#樣品為寧夏中寧枸杞,2#樣品為新疆精河枸杞,3#樣品為河北苦枸杞,4#樣品為云南黑枸杞。

1.3 樣品處理

1.3.1枸杞多糖的提取及純化

枸杞中多糖的提取采用80%(v/v)的乙醇提取法[22-23]。將枸杞干果置于真空干燥烘箱內(nèi),于50 ℃下烘干后粉碎,稱取干燥枸杞干果粉末置于燒杯中,加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,在80 ℃水浴中提取0.5 h,過濾濾渣,加蒸餾水在100 ℃水浴中再提取4 h,重復(fù)2次,合并濾液。

濾液采用Sevag法[24]脫去蛋白質(zhì)后,加入活性炭,70 ℃水浴1 h,過濾除去活性炭。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至黏稠,得到去除蛋白質(zhì)和色素的粗多糖。取適量枸杞粗多糖置于透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000),吊于裝有蒸餾水的大燒杯內(nèi),使其充分與水接觸,多次換水,透析24 h以除去小分子化合物和游離的單糖。將透析過的多糖置于蒸發(fā)皿中,冷凍干燥,得到相對(duì)純凈的枸杞多糖。將4個(gè)不同產(chǎn)地10個(gè)批次的枸杞干果按上述方法提取,制得枸杞多糖。

流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)表明,腦梗死的發(fā)生率在400/10萬-700/10萬之間[4],我國老齡化社會(huì)問題突出,該疾病的發(fā)生率也在增加,因此臨床中關(guān)注度高,該疾病的死亡率和殘疾率居高不下[5]。急性腦梗死是導(dǎo)致人類死亡的一個(gè)因素,急性腦梗死有四分之三的患者會(huì)出現(xiàn)肢體功能障礙,因此患者的生活受到了威脅,增加了患者的負(fù)擔(dān)。在研究中,腦梗死患者的搶救幾率比較高,但是由于腦組織缺氧缺血,導(dǎo)致了腦組織的損傷,治療后,患者存在不同程度的肢體功能障礙情況。因此,臨床中為了讓患者的殘疾率和死亡率下降,讓患者能夠自理生活,臨床中都是往這方面去研究和探討。

1.3.2枸杞多糖總糖含量的測定

枸杞中多糖總糖含量的測定采用硫酸苯酚法[25]。準(zhǔn)確稱取1.0 mg無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶,加水至刻度,其質(zhì)量濃度為100 mg/L,準(zhǔn)確移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于10 mL離心管中,加水至1.0 mL,再加入5%(v/v)苯酚溶液0.5 mL,搖勻,迅速加入2.5 mL濃硫酸(98%),搖勻后置于70 ℃恒溫水浴中30 min,取出后冷卻至室溫。以水作為空白,在490 nm波長處測吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取10 mg枸杞多糖樣品,用水定容至100 mL,準(zhǔn)確移取0.2、0.6、0.8 mL置于10 mL離心管中,加水至1.0 mL,再加入5%(v/v)苯酚溶液0.5 mL,搖勻,迅速加入2.5 mL濃硫酸,搖勻后置于70 ℃恒溫水浴中30 min,取出后冷卻至室溫。以水作為空白,在490 nm波長處測定吸光度,平行測定3次。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算枸杞多糖的質(zhì)量濃度。

1.3.3枸杞多糖的水解

準(zhǔn)確稱取枸杞多糖30 mg于30 mL的反應(yīng)釜中,加入2 mol/L的TFA溶液20 mL,密封反應(yīng)釜,置于干燥箱中,70 ℃下水解反應(yīng)50 min。

1.3.4PMP衍生化

分別移取各種單糖(Fruc、Glu、Rha、Xyl、Ara、Man、Gal、Rib)的氨水溶液300 μL于離心管中,加入0.3 mol/L PMP-甲醇溶液300 μL,渦旋混合,于70 ℃下水浴反應(yīng)2 h,冷卻后加300 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和,氮?dú)獯蹈?。在干燥后的殘留物中加?00 μL的水和500 μL CHCl3,渦旋1 min,除去CHCl3有機(jī)相(萃取過量的PMP),續(xù)3次加入500 μL的CHCl3,渦旋,除去CHCl3有機(jī)相,最后移取上清液于離心管中,高速離心10 min,移取上清液待HPLC-MS分析。

1.4 儀器條件

Kromasil-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm);流動(dòng)相A為100 mmol/L醋酸銨溶液,B為乙腈。線性梯度洗脫:0.1～5.0 min, 10%B～20%B; 5.0～30.0 min, 20%B～30%B; 30.0～45.0 min, 30%B～70%B; 45.0～47.0 min, 70%B; 47.0～50.0 min, 10%B。流速:0.35 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子(electron spray ionization, ESI)源正離子掃描模式,m/z80～800;選擇離子掃描(selective ion monitoring, SIM)模式進(jìn)行定量分析。表1為PMP標(biāo)記的8種單糖離子和對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間。毛細(xì)管電壓:3.5 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;干燥器流速:1.5 L/min,吹掃氣流速:0.1 MPa。采用SIM采集數(shù)據(jù)時(shí)PMP衍生化多種單糖產(chǎn)物的加和離子見表1。

表 1 PMP標(biāo)記的8種單糖離子及其保留時(shí)間(tR)Table 1 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP)-labeled eight monosaccharide ions and their retention times (tR)

圖 2 NaOH環(huán)境下PMP衍生化葡萄糖和果糖產(chǎn)物的總離子流色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms and the corresponding mass spectra of glucose and fructose derivatized by PMP under sodium hydroxide condition

2 結(jié)果與討論

2.1 PMP衍生化環(huán)境的優(yōu)化

在強(qiáng)堿NaOH條件下,采用PMP衍生化單糖是當(dāng)前最為普遍的單糖修飾技術(shù)[16-20],但是很難檢測到PMP衍生化果糖產(chǎn)物的信號(hào)[9,16-20]。因此,考察PMP衍生化單糖環(huán)境對(duì)衍生化產(chǎn)物的影響尤為必要。

2.1.1氫氧化鈉環(huán)境下PMP衍生化單糖的效果

分別移取Fruc和Glu水溶液300 μL于離心管中,加入300 μL 0.3 mol/L PMP-甲醇溶液和300 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液,渦旋混合,按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)。在NaOH環(huán)境下,PMP衍生化Glu和Fruc產(chǎn)物的總離子流色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖如圖2,可觀察到PMP衍生化Glu產(chǎn)物的離子化信號(hào)很弱,其衍生化產(chǎn)物的加和離子m/z為511,和文獻(xiàn)[18-20]一致。PMP修飾果糖的衍生化產(chǎn)物無信號(hào),也和文獻(xiàn)[9,16-20]一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明,在NaOH的強(qiáng)堿性環(huán)境下,PMP難以修飾果糖。以氨水代替NaOH,進(jìn)一步考察在溫和的NH3·H2O環(huán)境下,PMP能否衍生化果糖。

2.1.2氨水環(huán)境下PMP衍生化單糖的效果和機(jī)理

準(zhǔn)確移取Glu和Fruc氨水溶液各300 μL于離心管中,按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)。在NH3·H2O環(huán)境下,PMP衍生化Glu和Fruc的產(chǎn)物均有很強(qiáng)的離子化信號(hào)。圖3為Glu和Fruc在氨水環(huán)境下衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖。實(shí)驗(yàn)證明,在溫和的氨水環(huán)境下,Glu和Fruc經(jīng)PMP衍生化后生成了穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物,其加和離子分別為m/z511和510。

圖 3 NH3·H2O環(huán)境下PMP衍生化葡萄糖和果糖產(chǎn)物的總離子流色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖Fig. 3 Total ion chromatograms and the corresponding mass spectra of glucose and fructose derivatized by PMP under ammonia condition

在NaOH和NH3·H2O條件下,PMP衍生化Glu的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜檢測,其加和離子m/z均為511,與文獻(xiàn)[18-20,26-28]一致,其衍生化機(jī)理見圖4。PMP分子結(jié)構(gòu)中的2-位氮原子和羰基氧原子有較強(qiáng)的電負(fù)性,而堿性條件下缺少帶正電荷的H+,因此,這兩個(gè)基團(tuán)的電負(fù)性誘導(dǎo)吡唑環(huán)上的電子轉(zhuǎn)移。最終造成4-位碳原子上的電子云密度減小,碳?xì)滏I斷裂,氫以正離子的形式離開吡唑環(huán),與OH-結(jié)合形成一個(gè)水分子,而PMP則形成一個(gè)以4-位碳為活性中心的親核試劑。

圖 4 PMP衍生化葡萄糖的機(jī)理Fig. 4 Mechanism of glucose derivatized by PMP

在溶液中,單糖主要以環(huán)狀形式存在,尤其在堿性介質(zhì)中更穩(wěn)定,而在酸性介質(zhì)中不穩(wěn)定[29]。研究表明,單糖以環(huán)狀結(jié)構(gòu)在堿性溶液中與親核試劑發(fā)生反應(yīng)[27-29]。親核試劑PMP的活性中心4-位碳負(fù)離子首先進(jìn)攻醛單糖的1-位醛基碳,導(dǎo)致環(huán)狀單糖的碳氧鍵斷裂,醛糖1-位碳上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給氧原子形成OH,隨著一個(gè)水分子的失去,在醛糖1-位碳原子和PMP的4-位碳原子之間形成雙鍵,產(chǎn)生了單分子PMP標(biāo)記的單糖。此后,另一個(gè)處于親核狀態(tài)的PMP分子的4-位碳原子進(jìn)攻上一個(gè)PMP吡唑環(huán)與單糖1-位碳之間新形成的雙鍵。最終,2個(gè)PMP分子標(biāo)記1個(gè)醛糖Glu分子(Mr180),形成雙PMP(m/z174)的衍生化產(chǎn)物,其加和離子的m/z為511(即180+174×2-17)。

在NaOH條件下,PMP不修飾果糖,與文獻(xiàn)[9,16-20]報(bào)道相符。而在氨水條件下,PMP修飾果糖后,經(jīng)質(zhì)譜檢測獲得較強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào),其標(biāo)記物的加和離子m/z為510。顯然,衍生化環(huán)境的pH不影響衍生化產(chǎn)物,因此PMP標(biāo)記Fruc的衍生化機(jī)理如圖5所示。在NH3·H2O環(huán)境下,NH3作為親核試劑與果糖的羰基碳發(fā)生親核加成反應(yīng),生成式(2);式(2)中2-位碳上的OH與1-位碳上的H脫水生成式(3);式(3)發(fā)生烯醇式互變得到式(4),即得到含有NH2的醛糖(Mr179),其醛糖進(jìn)一步在NH3·H2O環(huán)境下與PMP發(fā)生衍生化。親核試劑PMP的4-位碳負(fù)離子首先進(jìn)攻醛基1-位碳原子,并和PMP的4-位碳原子之間形成雙鍵,產(chǎn)生了單分子PMP標(biāo)記的單糖。此后,另一個(gè)處于親核狀態(tài)的PMP分子的4-位碳原子進(jìn)攻上一個(gè)PMP吡唑環(huán)與單糖1-位碳之間新形成的雙鍵。最終,2個(gè)PMP分子標(biāo)記1個(gè)胺基醛糖分子(Mr179),形成雙PMP衍生化的產(chǎn)物,其加和離子的m/z為510(即179+174×2-17)。

從PMP親核試劑標(biāo)記果糖的機(jī)理分析,由于環(huán)狀呋喃型果糖的酮羰基與親核試劑NH3發(fā)生親核加成反應(yīng)的概率大,形成胺基醛糖的產(chǎn)率較高,經(jīng)PMP標(biāo)記后的質(zhì)譜信號(hào)也較強(qiáng),因此可在溫和的氨水環(huán)境下實(shí)現(xiàn)PMP對(duì)果糖的標(biāo)記,并且獲得靈敏度較高的MS檢測信號(hào)。然而,能否通過衍生化產(chǎn)物確定果糖的構(gòu)型還需進(jìn)一步的確認(rèn)。

圖 5 PMP衍生化果糖的機(jī)理Fig. 5 Mechanism of PMP-derivatized fructose

在溫和的NH3·H2O環(huán)境下,PMP成功的衍生化標(biāo)記了果糖和葡萄糖。我們提出了NH3·H2O環(huán)境下,PMP衍生化果糖的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)衍生化試劑PMP的用量、衍生化時(shí)間及對(duì)多種醛單糖衍生化產(chǎn)物的確認(rèn)做了大量的工作。6種醛單糖(Man、Rha、Gal、Xyl、Ara、Rib)的衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖6。

圖 6 NH3·H2O環(huán)境下PMP衍生化6種醛單糖產(chǎn)物的總離子流色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖Fig. 6 Total ion chromatograms and the corresponding mass spectra of six monosaccharides derivatized by PMP under ammonia condition

2.2 水熱法酸催化水解雙糖條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)[15-20, 26-28]報(bào)道,多糖水解的方法多采用高溫(120 ℃)、酸催化水解4 h的條件。較高的溫度和較長的水解時(shí)間對(duì)部分多糖造成一定程度的碳化破毀,使得部分單糖的回收率降低,從而影響水解樣品檢測的準(zhǔn)確性。由于糖苷鍵對(duì)水解的敏感性不同,以及水解成單糖的難易程度不同,到目前還無一種低溫快速的通用技術(shù)使植物多糖完全水解而不使其出現(xiàn)降解。

本文采用水熱法,TFA催化水解蔗糖和麥芽糖來優(yōu)化水熱法酸催化水解的最佳條件。稱取蔗糖、麥芽糖各0.01 g,置于30 mL的反應(yīng)釜中,加入2 mol/L的TFA溶液20 mL,分別在50、60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行酸水解反應(yīng)120 min后,按照1.3.4節(jié)進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)。采用HPLC-MS檢測雙糖水解產(chǎn)物中各單糖的回收率,以評(píng)價(jià)水熱法水解多糖的效率。圖7為不同溫度下,水熱法水解雙糖產(chǎn)物中單糖的回收率。先選定水解反應(yīng)時(shí)間為120 min,考察不同溫度下衍生化反應(yīng)的產(chǎn)率(以產(chǎn)物的色譜峰面積為縱坐標(biāo),水解溫度為橫坐標(biāo))。結(jié)果表明,在60～80 ℃范圍內(nèi),蔗糖和麥芽糖水解的單糖衍生物的峰面積達(dá)到最大值;溫度高于70 ℃時(shí),水解單糖的衍生化產(chǎn)物的峰面積趨于減小,尤其是在100 ℃時(shí),已經(jīng)檢測不到水解單糖的信號(hào)。因此本文選定水熱法水解反應(yīng)溫度為70 ℃。又考察了水解溫度在70 ℃時(shí),水解不同反應(yīng)時(shí)間(30～140 min)對(duì)衍生化反應(yīng)產(chǎn)率的影響(見圖8),其結(jié)果表明:水解50 min時(shí)蔗糖和麥芽糖水解產(chǎn)物的峰面積均達(dá)到最大值。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,低溫水熱法水解多糖的最佳條件為:酸催化水解的溫度為70 ℃和水解時(shí)間50 min。

圖 7 溫度對(duì)雙糖水解產(chǎn)物的產(chǎn)率的影響(n=3)Fig. 7 Effect of temperature on the yield of disaccharide hydrolysate (n=3) a. Glu, maltose hydrolyzed product; b. Glu, sucrose hydrolyzed product; c. Fruc, sucrose hydrolyzed product.

圖 8 70 ℃時(shí)水解時(shí)間對(duì)雙糖水解后產(chǎn)物的產(chǎn)率的影響(n=3)Fig. 8 Effect of hydrolysis time on the yield of disaccharide hydrolysate at 70 ℃ (n=3) a. Glu, maltose hydrolyzed product; b. Glu, sucrose hydrolyzed product; c. Fruc, sucrose hydrolyzed product.

表 2 PMP標(biāo)記的8種單糖的線性方程、回歸系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the eight PMP-labeled monosaccharides

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.3 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜-質(zhì)譜法分析單糖標(biāo)記產(chǎn)物,使用Kromasil-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm)。流動(dòng)相添加劑的選擇有利于提高分析的靈敏度,改善峰形,提高分離度。結(jié)合文獻(xiàn)[18-20],考察了0.1%(v/v)乙酸-乙腈和不同濃度乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相的效果。乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相有利于8種單糖標(biāo)記物的分離,提高檢測的靈敏度。同時(shí)又考察了10、50、100和120 mmoL/L乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,100 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相,基本實(shí)現(xiàn)6種單糖標(biāo)記物的分離,并且提高了每個(gè)單糖檢測的靈敏度。然而,考慮到Gal(19.82 min)和Rha(19.58 min)標(biāo)記物沒有達(dá)到基線分離,同時(shí)Glu和Man標(biāo)記物的加和離子m/z均為511, Xyl和Ara標(biāo)記物的加和離子m/z均為481,因此采用多通道SIM模式采集數(shù)據(jù)。圖9為多通道采集時(shí)PMP標(biāo)記的8種單糖標(biāo)記物的總離子流色譜圖。

圖 9 SIM模式下單糖PMP衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖Fig. 9 Total ion chromatogram of PMP-labeled monosaccharides in SIM mode Peaks: 1. Man; 2. Fruc; 3. Rha; 4. Gal; 5. Glu; 6. Xyl; 7. Ara; 8. Rib.

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1線性關(guān)系、檢出限、定量限

在最佳的色譜條件下,對(duì)8種單糖化合物在0.18～38.8 mg/L范圍內(nèi)進(jìn)行了方法驗(yàn)證。分別以信噪比(S/N)為3和10的質(zhì)量濃度為檢出限和定量限。線性方程、回歸系數(shù)(r2)、檢出限和定量限見表2。

2.4.2回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取枸杞多糖30 mg于30 mL的水熱反應(yīng)釜中,加入2 mol/L的TFA溶液20 mL,密封反應(yīng)釜并置于干燥箱中,70 ℃下酸催化水解反應(yīng)50 min,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中(多糖水解液的質(zhì)量濃度為300 mg/L),用蒸餾水定容。分別移取300 μL枸杞多糖水解液,置于10 mL的容量瓶中,加標(biāo)水平為8種單糖定量限的10倍(1.8 mg/L)和100倍(18.0 mg/L),用氨水定容。按照1.3.4節(jié)操作方法制備樣品,進(jìn)行HPLC-MS測定。加標(biāo)處理后的樣品溶液在一天內(nèi)重復(fù)測定5次并計(jì)算日內(nèi)精密度(RSD);重復(fù)測定5天并計(jì)算日間精密度(RSD)。平均加標(biāo)回收率為65.1%～116.2%,日內(nèi)精密度和日間精密度分別為3.8%～10.2%和6.6%～15.0%(見表3),說明PMP柱前標(biāo)記方法適用于枸杞多糖水解液中單糖的測定。

表 3 枸杞多糖樣品中8種單糖的加標(biāo)回收率及精密度(n=5)Table 3 Spiked recoveries and precisions of the eight monosaccharides in polysaccharide samples of Lycium barbarum L. (n=5)

圖 10 枸杞多糖水解溶液加標(biāo)(a)前、(b)后的PMP單糖標(biāo)記物的總離子流色譜圖Fig. 10 Total ion chromatograms of PMP-labeled monosaccharides from polysaccharides hydrolyzed samples of Lycium barbarum L. (a) before and (b) after spike

2.5 枸杞多糖水解產(chǎn)物衍生化單糖的測定

不同地區(qū)枸杞干果中提取的多糖及含量順序?yàn)?新疆精河枸杞(40.30 mg/g)>寧夏中寧枸杞(39.51 mg/g)>云南黑枸杞(31.02 mg/g)>河北苦枸杞(27.11 mg/g)。將4種市售枸杞多糖按照1.3.3節(jié)操作方法進(jìn)行枸杞多糖樣品的水熱法酸催化水解,再按照1.3.4節(jié)操作方法衍生化標(biāo)記水解產(chǎn)物中的單糖,然后進(jìn)行HPLC-MS測定(見圖10)。

通過比較發(fā)現(xiàn),4種市售枸杞多糖水解產(chǎn)物中PMP單糖標(biāo)記物組分與8種標(biāo)準(zhǔn)單糖標(biāo)記物的出峰順序、保留時(shí)間、PMP標(biāo)記離子的m/z完全一致,從而確認(rèn)4個(gè)地區(qū)10批自制枸杞多糖水解產(chǎn)物中均含甘露糖、果糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和脫氧核糖,并對(duì)各種單糖組分的含量進(jìn)行了測定。以1#枸杞多糖樣品中含有的各種單糖含量為單位(中國藥典2 010版注明寧夏枸杞為藥食兩用枸杞品種),計(jì)算不同地區(qū)枸杞多糖中各種單糖的分布比值(見圖11)。產(chǎn)自不同地區(qū)枸杞多糖中單糖的組成基本一致,但所含各種單糖含量的分布有較大差異,說明藥材的產(chǎn)地對(duì)枸杞多糖的單糖組成有一定影響。

圖 11 4個(gè)地區(qū)10批枸杞多糖中單糖組分分布比值圖(n=3)Fig. 11 Distribution ratio chart of monosaccharide composition from polysaccharide samples of Lycium barbarum L. of ten batches from four regions (n=3)

3 結(jié)論

在溫和的NH3·H2O環(huán)境下,采用PMP衍生化標(biāo)記單糖,基于HPLC-MS聯(lián)用技術(shù),在正離子SIM模式下,成功確認(rèn)和測定了果糖和多種醛單糖(Man、Rha、Gal、Glu、Xyl、Ara、Rib)。首次提出在溫和的NH3·H2O條件下,PMP標(biāo)記果糖的衍生化機(jī)理。以雙糖為目標(biāo)物,優(yōu)化水熱法酸催化水解多糖的最佳水解溫度(70 ℃)和水解時(shí)間(50 min),建立了水熱法水解多糖和溫和氨水環(huán)境下PMP柱前標(biāo)記多糖水解產(chǎn)物中的果糖和多種醛單糖的確認(rèn)方法及含量測定方法,成功用于枸杞多糖水解產(chǎn)物中單糖組分的確認(rèn)及含量測定。