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    不同產(chǎn)地女貞子化學(xué)質(zhì)量特征分析

    2019-10-11 06:04:56祝俠麗張迪文謝彩俠雷敬衛(wèi)
    關(guān)鍵詞:女貞子女貞紅景天

    祝俠麗,張迪文,謝彩俠*,雷敬衛(wèi)

    1河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,鄭州 450046;2 河南省中醫(yī)研究院中藥研究所,鄭州 450006

    女貞子為木犀科女貞屬植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果實(shí),具有滋補(bǔ)肝腎,明目烏發(fā)的療效[1],是一味傳統(tǒng)的扶正固本藥物。女貞子喜光耐蔭,主要分布在我國(guó)廣東、浙江、湖南、湖北、四川、河南等暖濕潤(rùn)氣候地區(qū),研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的女貞子有效成分的含量差異較大[2],而在女貞子臨床用藥過(guò)程中,并未對(duì)女貞子的產(chǎn)地做明確規(guī)定及要求,2015年版《中國(guó)藥典》也僅僅用特女貞苷作為女貞子質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo),不能真實(shí)反映和區(qū)分不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量的差異,影響了女貞子質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性及臨床用藥的合理性。

    中藥材功效的產(chǎn)生是其內(nèi)在多種化學(xué)成分相互協(xié)同產(chǎn)生的,單純的指標(biāo)性成分并不能真實(shí)反映與其功效相一致的藥效物質(zhì),而HPLC指紋圖譜提供的化學(xué)質(zhì)量信息豐富,可以相對(duì)全面的表征中藥的整體化學(xué)質(zhì)量特征,目前已廣泛應(yīng)用于中藥材的產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量控制中[3,4]。本研究基于HPLC指紋圖譜的優(yōu)點(diǎn)及女貞子藥材在生產(chǎn)中存在的問(wèn)題,收集全國(guó)主要產(chǎn)區(qū)的女貞子藥材,對(duì)其中的女貞苷、特女貞苷及紅景天苷的含量進(jìn)行測(cè)定,并分析比較其HPLC指紋圖譜特征,為不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量特征的確定、女貞子質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的完善及女貞子藥材質(zhì)量可追溯系統(tǒng)的構(gòu)建提供依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Waters2695自動(dòng)高效液相色譜儀(配有Waters2998檢測(cè)器);Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱(北京迪馬科技有限公司);CPA225D十萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);ME54E型萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司);TY-500型超聲波清洗儀(北京天佑恒達(dá)科技有限公司);SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);SZFJ-300型多用藥材粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司);DZEW-5型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    甲醇和乙腈(色譜純,Tedia Company);甲醇和乙醇(分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);娃哈哈純凈水;蒸餾水(自制);特女貞苷、女貞苷、紅景天苷對(duì)照品(批號(hào)分別為MUST-14040402、MUST-14062606、MUST-14071814,純度均≥98%,成都曼思特生物科技有限公司。)

    1.3 樣品來(lái)源

    收集河南、湖南、四川、浙江4個(gè)產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地的女貞子飲片24批(見(jiàn)表1)。將女貞子飲片粉碎過(guò)40目篩,放于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 不同產(chǎn)地女貞子樣品信息

    2 內(nèi)容與結(jié)果

    2.1 不同產(chǎn)地女貞子中特女貞苷、女貞苷及紅景天苷含量測(cè)定

    特女貞苷的含量測(cè)定參考2015版《中國(guó)藥典》中女貞子含量測(cè)定項(xiàng)下的方法。女貞苷及紅景天苷的含量測(cè)定均按照文獻(xiàn)[5]中所建立的方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)三次,取其平均值。三種成分對(duì)照品和女貞子樣品的高效液相色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2、圖3。不同產(chǎn)地女貞子特女貞苷、女貞苷及紅景天苷的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

    由圖4知,不同產(chǎn)地女貞子中特女貞苷含量最高,女貞苷含量次之,紅景天苷含量最低,三種成分的含量受產(chǎn)地的影響較大,女貞苷、特女貞苷和紅景天苷在女貞子藥材中含量的波動(dòng)范圍分別為0.92%~3.12%、3.96%~7.45%和0.05%~0.15%,而且四個(gè)產(chǎn)地之間表現(xiàn)的特征不同。其中,河南產(chǎn)地三個(gè)產(chǎn)區(qū)的特女貞苷及紅景天苷含量相對(duì)穩(wěn)定,而女貞苷含量有一定差異;湖南產(chǎn)地三個(gè)產(chǎn)區(qū)之間女貞苷含量差異相對(duì)較小,特女貞苷及紅景天苷含量差異較大;四川產(chǎn)地不同產(chǎn)區(qū)之間女貞子中紅景天苷含量較為穩(wěn)定,其他兩個(gè)指標(biāo)變化較大;浙江產(chǎn)地兩個(gè)產(chǎn)區(qū)三個(gè)指標(biāo)的含量均有明顯差異。另外,四個(gè)產(chǎn)地中湖南產(chǎn)地女貞子中女貞苷的含量整體較高,河南和四川兩個(gè)產(chǎn)地的含量比較接近,單因素方差分析表明,四個(gè)產(chǎn)地之間無(wú)顯著性差異;四川和河南兩個(gè)產(chǎn)地女貞子中特女貞苷含量整體較高,但四個(gè)產(chǎn)地之間無(wú)顯著性差異;四川產(chǎn)地女貞子中紅景天苷含量較高,與其他三個(gè)產(chǎn)地的女貞子之間存在顯著性差異(P<0.05)。

    圖1 女貞子中特女貞苷HPLC色譜圖(A:對(duì)照品;B:樣品)Fig.1 HPLC of the specnuezhenide of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

    圖2 女貞子中女貞苷HPLC色譜圖(A:對(duì)照品;B:樣品)Fig.2 HPLC of the ligustroflavone of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

    圖3 女貞子中紅景天苷HPLC色譜圖(A:對(duì)照品;B:樣品)Fig.3 HPLC of the salidroside of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

    圖4 不同產(chǎn)地女貞子中三種成分的含量 (A:河南;B:湖南;C:四川;D:浙江)Fig.4 The content of specnuezhenide,ligustroflavone and salidroside of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A:Henan;B:Hunan;C:Sichuan;D:Zhejiang)

    2.2 女貞子HPLC指紋圖譜方法的建立

    2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

    分別精密稱取女貞苷、特女貞苷、紅景天苷對(duì)照品適量,分別加甲醇制成濃度為0.113、0.145、0.183 mg/mL的女貞苷、特女貞苷和紅景天苷對(duì)照品溶液。

    2.2.2 供試品溶液的制備

    精密稱定女貞子粉末約0.4 g,置具塞錐形瓶中,精密量取稀乙醇25 mL,稱定重量,加熱回流1h,放冷,稱重,用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾后即得供試品溶液。

    2.2.3 色譜條件

    色譜柱:Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(0~25 min:10%乙腈→25%乙腈);25~50 min:25%乙腈);流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm。

    分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中,按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,對(duì)照品及供試品溶液的高效液相色譜圖見(jiàn)圖5。

    圖5 對(duì)照品(A)和女貞子樣品(B)HPLC指紋圖譜(a:紅景天苷;b:女貞苷;c:特女貞苷)Fig.5 HPLC fingerprints of control(A)and Ligustri Lucidi Fructus(a:salidroside;b:ligustroflavone;c:specnuezhenide)

    2.2.4 方法學(xué)考察

    2.2.4.1 精密度試驗(yàn)

    精密稱取S-XF13號(hào)女貞子粉末,按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按照“2.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖中共有峰的保留時(shí)間和峰面積,以共有峰12號(hào)峰作為參照峰,計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值,結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.00%~0.31%之間,相對(duì)峰面積的RSD值在0.00%~1.32%之間,符合指紋圖譜的要求。

    2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

    精密稱取H-ZM2號(hào)樣品6份,按照精密度試驗(yàn)的方法獲取6份供試品溶液的指紋圖譜,并計(jì)算其主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值,結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.00%~ 0.40%之間,相對(duì)峰面積的RSD值在0.00%~2.21%之間,符合指紋圖譜的要求。

    2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    精密稱取H-ZZ5號(hào)樣品粉末,按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,分別放置0、2、4、8、12、24 h后測(cè)定其相應(yīng)指紋圖譜,并計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值,結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.00%~ 0.31%之間,相對(duì)峰面積的RSD值在0.00%~2.17%之間,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3 不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜特征分析

    2.3.1 不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜共有模式的生成

    分別從河南、湖南、四川、浙江4個(gè)省份中各選取4批代表性的女貞子樣品粉末,按照2.2項(xiàng)下的方法獲取16批女貞子樣品的HPLC指紋圖譜(見(jiàn)圖6)。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,設(shè)S1為參照?qǐng)D譜,設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.3,采用中位數(shù)法,通過(guò)自動(dòng)匹配及多點(diǎn)校正生成指紋圖譜的共有模式(見(jiàn)圖7),共標(biāo)定14個(gè)共有峰。結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜色譜峰的數(shù)目基本相同,說(shuō)明不同產(chǎn)地女貞子的化學(xué)成分種類基本一致,但其中2號(hào)峰、紅景天苷、4號(hào)峰、6號(hào)峰、女貞苷及14號(hào)峰等的峰面積差異較大。

    圖6 16批女貞子HPLC指紋圖譜疊加圖Fig.6 Vertical overlap of HPLC fingerprints for 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus

    圖7 女貞子飲片HPLC指紋圖譜共有模式(3:紅景天苷 11:女貞苷 12:特女貞苷)Fig.7 HPLC fingerprint common pattern of Ligustri Lucidi Fructus(3:salidroside;11:ligustroflavone;12:specnuezhenide)

    2.3.2 不同產(chǎn)地女貞子指紋圖譜相似度分析

    采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件,以生成的女貞子指紋圖譜的共有模式為標(biāo)準(zhǔn),其相似度為1.000,對(duì)不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算,并對(duì)各樣品圖譜間的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)(見(jiàn)表3)。

    表3 不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜相似度

    由表可知,不同產(chǎn)地女貞子指紋圖譜的相似度差異較大,河南及浙江女貞子與女貞子的共有模式相比,指紋圖譜的相似度均在0.9以上,說(shuō)明這兩個(gè)產(chǎn)地的女貞子質(zhì)量基本可以代表女貞子的質(zhì)量特征;湖南與四川產(chǎn)地的女貞子相似度較低,而且四川不同樣品之間差異較大,說(shuō)明這兩個(gè)產(chǎn)地的女貞子除了具有所有女貞子質(zhì)量特征的共性外,還表現(xiàn)出明顯的地域性特征,這可能與湖南、四川的氣候環(huán)境有一定關(guān)系。

    2.3.3 不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜的主成分分析和聚類分析

    為篩選引起不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量差異的特征成分,比較不同產(chǎn)地女貞子樣品之間化學(xué)質(zhì)量的相似性,為不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量特征的確定提供科學(xué)依據(jù),本研究進(jìn)一步對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了主成分分析和聚類分析。

    2.3.3.1 主成分分析

    將不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜共有模式中共有峰的相對(duì)峰面積及保留時(shí)間分別作為原始信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析。設(shè)特征值1為提取標(biāo)準(zhǔn),選擇合適的主成分?jǐn)?shù),使方差貢獻(xiàn)率累計(jì)值達(dá)到78%~ 90%,以保證提取的信息基本涵蓋原樣品的特征,以準(zhǔn)確反映不同產(chǎn)地16批樣品之間的質(zhì)量表達(dá)差異性。經(jīng)過(guò)對(duì)四個(gè)產(chǎn)地16批女貞子樣品HPLC指紋圖譜主成分分析得到各主成分的特征值(見(jiàn)表4)、主成分?jǐn)?shù)的碎石圖(圖6)及各主成分所代表的共有峰的矩陣(見(jiàn)表5)。

    主成分的貢獻(xiàn)率反映了該成分所代表的色譜峰對(duì)原變量的解釋度。不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜主成分分析中的主成分特征值及碎石圖分析結(jié)果表明,前5個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率綜合達(dá)到78.007%,它們基本反映了16批樣品指紋圖譜中的大部分信息。主要因子載荷矩表結(jié)果顯示第1主成分主要反映了色譜峰4、6、9、14的信息,其中6號(hào)峰的載荷最高;第2主成分主要反映了色譜峰8、女貞苷的信息,其中女貞苷的載荷最高。第3主成分主要反映了色譜峰1、紅景天苷、13的信息,其中紅景天苷的載荷最高;第4主成分主要反映了色譜峰2、8的信息,其中8號(hào)峰的載荷最高。因此,除特女貞苷外,6號(hào)色譜峰所代表的成分、女貞苷、紅景天苷及8號(hào)色譜峰所代表的成分可能是引起不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量特征差異的主要指標(biāo)。

    表4 主成分特征值

    2.3.3.2聚類分析

    分別將四個(gè)產(chǎn)地16批女貞子指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析,選擇組間連接為聚類分析的方法,平方歐式距離為距離的測(cè)量公式,繪制聚類分析的樹(shù)狀圖(見(jiàn)圖7)(s1 ~ s4為河南女貞子樣品;s5 ~ s8為湖南女貞子樣品;s9 ~ s12為四川女貞子樣品;s13 ~ s16為浙江女貞子樣品)。由聚類分析結(jié)果知,不同產(chǎn)地的女貞子樣品質(zhì)量特征相互交叉,無(wú)明顯規(guī)律性,而且相同產(chǎn)地的女貞子樣品也并沒(méi)有聚為一類。

    表5 主要因子載荷矩陣表

    圖8 碎石圖Fig.8 Scree plot

    圖9 不同產(chǎn)地女貞子HPLC指紋圖譜聚類分析Fig.9 The systematic cluster analysis of HPLC fingerprint of Ligustri Lucidi Fructus from different areas

    3 討論

    中藥材生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是中藥材產(chǎn)生臨床功效的物質(zhì)基礎(chǔ),也是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)。次生代謝產(chǎn)物含量的高低受藥材品種[6,7]、產(chǎn)區(qū)環(huán)境[8]、栽培方式[9]、采收時(shí)期[10]、加工方式[11]等多種因素的影響,而且不同種類的次生代謝產(chǎn)物,決定其合成與積累的關(guān)鍵生態(tài)因子及人文因子不同。本研究結(jié)果表明,由于女貞子在我國(guó)分布較為廣泛,不同產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境及栽培管理措施差異較大,導(dǎo)致了女貞子中女貞苷、特女貞苷及紅景天苷的含量及不同產(chǎn)區(qū)三種成分的表現(xiàn)特征均具有一定的差異,其中紅景天苷含量受產(chǎn)地的影響較大,表明了中藥材質(zhì)量的形成主要是種質(zhì)與環(huán)境共同作用的結(jié)果。

    道地藥材是在特定地域與特定生長(zhǎng)環(huán)境,并通過(guò)特定的生產(chǎn)加工過(guò)程生產(chǎn)的,較其他產(chǎn)地的同種藥材質(zhì)量好、品質(zhì)佳、療效好的,具有較高知名度與認(rèn)可的中藥材,具有明顯的地域性。一般情況下,分布較為廣泛的藥材對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求相對(duì)較低,地域性不明顯,因此藥材的產(chǎn)地質(zhì)量特征可能并不明顯,而中藥材是一種多組分通過(guò)多靶點(diǎn)產(chǎn)生臨床功效的特殊藥品,單純的幾個(gè)化學(xué)成分并不能真實(shí)反映與其臨床功效相一致的質(zhì)量特征,HPLC 指紋圖譜則可以較為全面的評(píng)價(jià)藥材的整體化學(xué)質(zhì)量,相對(duì)真實(shí)的反映其臨床功效。本研究以女貞子中女貞苷、特女貞苷及紅景天苷等環(huán)烯醚萜苷和苯乙醇苷類成分為指標(biāo)建立了四個(gè)產(chǎn)地不同來(lái)源的16批女貞子樣品HPLC指紋圖譜來(lái)表征女貞子的化學(xué)質(zhì)量,同時(shí)利用相似度分析、主成分分析和聚類方法分析不同產(chǎn)地女貞子的質(zhì)量特征差異。相似度分析表明不同產(chǎn)地女貞子在化學(xué)成分種類一致的情況下,其差異主要體現(xiàn)在某些化學(xué)成分含量的高低上,其中河南、浙江兩產(chǎn)地的女貞子藥材質(zhì)量特征比較接近,而湖南、四川兩產(chǎn)地的女貞子與河南、浙江的差異較大,但聚類分析結(jié)果表明四個(gè)產(chǎn)地的女貞子藥材質(zhì)量特征相互交叉,并沒(méi)有表現(xiàn)出區(qū)別于其他產(chǎn)地的明顯特征。這與相似度分析的結(jié)果不太一致,因此在評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地藥材化學(xué)質(zhì)量特征時(shí),應(yīng)盡可能同時(shí)采用多種分析方法,以真實(shí)反映不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量差異。

    特女貞苷是女貞子中含量較高的一種環(huán)烯醚萜苷類成分,具有明顯的藥理作用,因此,2015 年版《中國(guó)藥典》以特女貞苷含量作為控制女貞子質(zhì)量的指標(biāo)具有一定的合理性。主成分分析表明,女貞苷和紅景天苷在內(nèi)的10個(gè)色譜共有峰均不同程度的參與了不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量差異的表達(dá),而女貞苷和紅景天苷均具有與女貞子滋補(bǔ)肝腎功效相一致的藥理活性[12],但2015版《中國(guó)藥典》并沒(méi)有將其作為評(píng)價(jià)女貞子質(zhì)量的指標(biāo)性成分。因此為了科學(xué)全面的反映不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量,女貞子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還有待于進(jìn)一步研究與完善。

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